芽孢杆菌源脂肽抑制与根除热带念珠菌生物膜的体外探索：机制与协同效应研究

本研究针对WHO高优先级病原体热带念珠菌（C. tropicalis）生物膜耐药性问题，从Bacillus subtilis RLID菌株中纯化出脂肽AF4 和AF5 ，通过XTT代谢活性检测、CV生物量分析及CLSM等多项技术证实其可显著抑制生物膜形成并破坏成熟生物膜结构，与氟康唑（FLC）联用展现协同效应，为抗真菌耐药提供新策略。

　　

研究背景
热带念珠菌（C. tropicalis）作为世界卫生组织（WHO）重点关注的侵袭性真菌病原体，其生物膜形成能力导致临床治疗失败率居高不下。生物膜中胞外聚合物（EPS）构成的物理屏障使传统抗真菌药物（如氟康唑FLC）的渗透效率降低千倍，而ERG11基因突变等机制进一步加剧耐药性。尤其亚洲地区FLC耐药率高达8.3%，迫使科研人员从天然产物中寻找突破口。芽孢杆菌（Bacillus）分泌的脂肽类物质因其两亲性结构和膜靶向特性，成为对抗真菌生物膜的潜在武器。

研究机构与方法
国内研究人员通过优化Bacillus subtilis RLID 12.1菌株的发酵工艺，采用半制备型高效液相色谱（HPLC）结合C18柱纯化获得脂肽AF₄
和AF₅
，经LC-MS鉴定分子量分别为1072.10和1086.10 Da。研究以热带念珠菌ATCC 750为模型，通过以下关键技术：

1. 生物膜阶段分析：0 h（黏附期）、6 h（发育期）、24 h（成熟期）三阶段干预；
2. 多维度评估：XTT代谢活性检测、结晶紫（CV）生物量定量、EPS酚硫酸法测定；
3. 形态学表征：场发射扫描电镜（FE-SEM）观察超微结构，共聚焦显微镜（CLSM）结合ConA-FUN-1双染色三维重建；
4. 协同效应验证：棋盘法分析AF₄
   /AF₅
   与FLC联用效果。

研究结果

1. 脂肽的纯化与特性
通过放大制备型HPLC流程，AF₄
和AF₅
产量提升至600-1000 μg/mL，质谱验证纯度达单峰标准。两者对浮游细胞的MIC均为4 μg/mL，与FLC联用可使FLC的MIC降低2倍。

2. 生物膜抑制与根除
AF₄
单独作用（16 μg/mL）对24 h成熟生物膜的生物量减少93%，代谢活性抑制94%，显著优于AF₅
（50.1%）。FLC（128 μg/mL）单独处理仅降低50%生物量，但与AF₅
联用后生物膜清除率提升至74%。

3. 形态学破坏
SEM显示AF₄
处理导致生物膜细胞膜孔洞化，伪菌丝结构瓦解；CLSM三维重建证实AF₄
处理组生物量（μm³
/μm²
）和平均厚度（μm）分别减少76.1%和70%。

4. EPS与生化组分干预
AF₄
使成熟生物膜EPS含量降低76.1%，ATR-FTIR分析显示酰胺I带（1632 cm^-1
）和羧酸基团信号减弱，表明脂肽破坏了β-葡聚糖等关键基质成分。

结论与意义
该研究首次系统阐明Bacillus源脂肽AF₄
通过破坏EPS屏障和细胞膜完整性，实现对热带念珠菌生物膜的多阶段干预。其与FLC的协同效应为临床联合用药提供理论依据，尤其对亚洲高发的FLC耐药株具有转化潜力。未来可进一步探索脂肽在医疗器械涂层或局部给药中的应用，以应对WHO警示的真菌耐药危机。论文发表于《Biofilm》，为抗生物膜药物开发树立了新范式。