新型吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物的设计、合成及抗癌活性研究：CDK2抑制机制与分子模拟

研究人员针对CDK2靶点设计合成了一系列吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物，通过NCI-60细胞系筛选发现化合物3d对肾癌A498细胞具有显著抑制活性（GI50 =0.0263 μM），其CDK2/CyclinA2抑制能力（IC50 =0.332 μM）优于阳性药roscovitine。该研究为开发新型CDK2抑制剂提供了先导化合物。

　　

癌症作为全球第二大死因，其治疗面临化疗耐药和靶向药物选择性不足等挑战。CDK2（细胞周期蛋白依赖性激酶2）作为调控细胞周期G1/S转换的关键蛋白，在多种肿瘤中异常激活，但现有抑制剂如roscovitine存在选择性欠佳等问题。吡唑并[3,4-d]嘧啶骨架因其多靶点调控特性成为药物研发热点，但如何通过结构优化提升其对CDK2的选择性抑制仍是未解难题。

国内研究人员通过等排置换策略，以roscovitine为先导化合物，设计合成三个系列共9个新型吡唑并嘧啶衍生物。采用NCI-60细胞系筛选发现，化合物3d对肾癌A498细胞展现超强抑制活性（GI₅₀
=0.0263 μM，TGI=0.0854 μM），其CDK2/CyclinA2抑制活性（IC₅₀
=0.332±0.018 μM）显著优于对照药roscovitine（0.457±0.025 μM）。分子机制研究表明，3d能下调CDK2总蛋白水平并抑制Thr¹⁶⁰
位点磷酸化，通过诱导S期阻滞和激活caspase-3（提升8.84倍）触发细胞凋亡。分子对接显示3d通过氢键与CDK2的Leu⁸³
和Glu⁸¹
形成稳定相互作用，分子动力学模拟证实其蛋白-配体复合物RMSD<2 ?。该成果发表于《Bioorganic Chemistry》，为开发高选择性CDK2抑制剂提供了新思路。

关键技术包括：1）基于NCI-60细胞系的五剂量抗增殖筛选；2）CDK2/CyclinA2激酶活性检测（放射性同位素法）；3）流式细胞术分析细胞周期和凋亡；4）分子对接（AutoDock Vina）和100 ns分子动力学模拟（GROMACS）。

研究结果

1. 化学合成与表征：通过环化反应构建吡唑并嘧啶核心骨架，引入苯基（3b-e）和吲哚基（5d）等疏水基团，经IR、¹
   H/¹³
   C NMR和HPLC确证结构。

2. 抗癌活性筛选：3d对白血病SR细胞（GI₅₀
   =0.042 μM）和肾癌A498细胞（GI₅₀
   =0.0263 μM）表现广谱活性，3e对A498的GI₅₀
   为0.237 μM。

3. 激酶抑制机制：3d选择性抑制CDK2（IC₅₀
   =0.332 μM），Western blot显示其降低CDK2表达量并阻断Thr¹⁶⁰
   磷酸化，破坏CAK（CDK激活激酶）介导的活化途径。

4. 细胞周期与凋亡：3d使A498细胞S期比例增加2.1倍，总凋亡率提升26.95倍，caspase-3活性显著增强。

5. 计算模拟：3d与CDK2的ATP结合口袋形成4个氢键，MM-PBSA计算结合自由能为-28.6 kcal/mol，优于roscovitine（-25.3 kcal/mol）。

结论与意义
该研究通过理性设计获得先导化合物3d，其通过双重机制（抑制CDK2活性和下调蛋白表达）发挥抗癌作用。相较于传统嘌呤类抑制剂，吡唑并嘧啶骨架展现出更优的激酶选择性和成药性潜力。分子模拟为后续结构优化提供了明确方向，如增强与Glu⁸¹
的静电相互作用。该工作不仅为肾癌治疗提供了候选药物，更为开发靶向细胞周期调控的抗癌药物奠定了理论基础。