利用嗜热菌转酮醇酶和假单胞菌差向异构酶高效生产D-景天庚酮糖及其差向异构化反应研究

本研究针对稀有七碳糖生产成本高的问题，开发了基于嗜热菌Thermus thermophilus HB8来源的转酮醇酶(TtTK)和Pseudomonas cichorii ST24来源的D-塔格糖-3-差向异构酶(D-TE)的高效生产体系。研究发现5-酮基-D-果糖(5-KF)是最佳供体底物，在50°C、500 mM底物浓度下可高效合成D-景天庚酮糖，并首次证实D-TE可催化D-景天庚酮糖与D-阿洛庚酮糖的差向异构化反应(转化率55%)，为稀有七碳糖的规模化生产提供了新策略。

　　

在糖生物学领域，七碳糖作为一类罕见的单糖，因其独特的生理功能日益受到关注。D-甘露庚酮糖已被证实可通过抑制胰脏β细胞中葡萄糖激酶活性来调节胰岛素分泌，展现出潜在的糖尿病治疗价值。然而，自然界中七碳糖含量极低，传统化学合成法成本高昂，严重制约了其功能研究和应用开发。目前关于稀有糖的研究多集中于4-6碳糖，对七碳糖的高效生物合成仍缺乏系统研究。

日本香川大学农业学部应用生物科学系的Kana Watanuki等研究人员在《Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry》发表研究，创新性地利用嗜热菌Thermus thermophilus HB8来源的热稳定性转酮醇酶(TtTK)和Pseudomonas cichorii ST24来源的D-塔格糖-3-差向异构酶(D-TE)，建立了从廉价底物高效生产两种七碳糖的生物催化体系。研究突破了传统依赖昂贵底物锂羟基丙酮酸(Li-HPA)的限制，为稀有七碳糖的规模化生产提供了新思路。

研究采用以下关键技术方法：(1)通过Gluconobacter cerinus NBRC 3267发酵制备5-KF；(2)优化TtTK反应条件评估14种供体底物和8种受体底物；(3)HPLC结合¹³
C-NMR鉴定产物结构；(4)利用D-TE催化差向异构化反应并测定平衡常数。

【供体底物筛选】研究发现5-KF作为供体底物时D-景天庚酮糖产量达19.9 mM，仅次于Li-HPA(22.6 mM)，显著优于其他12种测试底物。5-KF分子中C2和C5位的双重酮基使其能发生两次转移反应，推动反应平衡向产物方向移动。

【受体底物特异性】证实D-甘油构型(2R)的戊糖(D-核糖、L-来苏糖、D-木糖和L-阿拉伯糖)可作为有效受体，分别生成D-景天庚酮糖(27.3 mM)、L-半乳庚酮糖(25.7 mM)、D-艾杜庚酮糖(13.3 mM)和L-葡萄庚酮糖(12.7 mM)。

【反应条件优化】确定50°C为最佳反应温度，500 mM底物浓度下D-景天庚酮糖产量达153.9 mM(转化率30.8%)。高温反应既可提高酶活又能降低体系粘度，体现嗜热酶的应用优势。

【差向异构化反应】首次发现D-TE可催化D-景天庚酮糖与D-阿洛庚酮糖的相互转化，平衡比为45:55。通过LC/MS和¹³
C-NMR确证产物结构，光学旋光度测定([α]²⁰
_D
=7.2°)与标准品一致。

该研究实现了三大突破：(1)开发了基于5-KF的廉价供体系统，较传统Li-HPA降低成本约80%；(2)建立了高温高效(50°C)的七碳糖生产平台；(3)拓展了D-TE的底物谱，首次证实其对七碳酮糖的差向异构能力。这些发现不仅为七碳糖的规模化生产奠定基础，更为探索其降血糖等生理功能提供了物质保障。未来研究可进一步优化酶工程改造和工艺放大，推动稀有七碳糖在功能性食品和药物开发中的应用。