衍生化增强EIEIO驱动的糖苷键测序技术(DEED-GL-Seq)开发及其在糖原来源寡糖分析中的应用

为解决寡糖结构复杂性导致的生物功能解析难题，研究人员开发了衍生化增强EIEIO驱动的糖苷键测序技术(DEED-GL-Seq)。该技术通过T3衍生化放大糖苷键电子密度差异，结合EIEIO MS2生成键型特异性诊断片段，实现了无需标准品的糖苷键序列测定。应用于糖原水解产物分析，成功鉴定出GSD-II新型生物标志物(HEX-1/2, HEPTA-1/2)，为糖组学研究提供了突破性工具。

　　

糖类作为生命四大基础物质之一，其结构复杂性长期困扰着科研人员。与核酸和蛋白质的线性序列不同，寡糖通过α-1,4、α-1,6等不同糖苷键连接形成的分支结构，会产生天文数字般的异构体。这些"甜蜜密码"的细微差异能显著影响蛋白质功能，甚至与糖原贮积病(GSD)等重大疾病相关。然而现有分析技术如CID-MS/MS（碰撞诱导解离串联质谱）难以区分键型异构体，而依赖标准品的传统方法面对复杂糖链时更是捉襟见肘。

中国医学科学院的研究团队另辟蹊径，将化学衍生化的"放大镜"效应与电子诱导电离有机质谱(EIEIO)的"分子手术刀"特性相结合，开创了DEED-GL-Seq技术。该技术采用特殊设计的T3衍生化试剂(N²,N²,N⁴,N⁴-四乙基-6-肼基-1,3,5-三嗪-2,4-二胺)，通过调控糖苷键周围电子云分布，使EIEIO能精准切割特定键型产生诊断性碎片。经HILIC（亲水相互作用色谱）分离后，高分辨质谱可捕获这些"分子指纹"，实现从二糖到七糖的键型测序。

关键技术方法
研究团队首先优化了T3衍生化反应条件，通过比较12种常见二糖（如麦芽糖、异麦芽糖）的EIEIO碎片模式，建立了α-1,4与α-1,6键型的特征离子数据库。采用健康人与GSD-II患者尿液样本，结合部分水解的糖原标准品，通过碎片丰度比定量分析分支程度。该实验是在配备EIEIO碎裂技术的ZenoTOF 7600质谱仪上完成， 数据处理软件通过SCIEX OS软件（版本3.0）进行处理 。

Efficient discrimination of α-1,4 and α-1,6 glycosidic linkage
对比实验显示，传统CID-MS²仅产生非特异性脱水碎片(-18 Da)，而DEED-GL-Seq能生成键型特异性标志物：α-1,4键产生m/z 503.2154的[B₂-H₂O]⁺离子，α-1,6键则生成m/z 417.2028的[Y₁+T3]⁺离子。这种差异在更大的三糖、四糖体系中仍保持稳定，验证了方法的普适性。

Application to glycogen-sourced oligosaccharides
分析糖原水解产物时，通过特征三糖(Glc₃)的丰度比计算出糖原分支度为8.3%，与文献报道的7-10%高度吻合。更令人振奋的是，在GSD-II患者尿液中发现了4种新型寡糖：HEX-1/2（六糖）和HEPTA-1/2（七糖），其诊断灵敏度达92.3%，显著优于传统标志物Glc₄。特别是HEX-2的特殊结构暗示GSD-II中存在未知的生物合成途径。

结论与展望
该研究突破了糖组学领域长期存在的"标准品依赖"瓶颈，DEED-GL-Seq技术的三大创新点在于：①T3衍生化创造电子密度梯度；②EIEIO实现键型特异性断裂；③算法辅助的自动化解析。这不仅为糖原代谢疾病提供了新型生物标志物，其"电子环境调控"策略更为复杂生物大分子分析开辟了新范式。未来通过扩展至其他糖苷键型（如β-1,3），有望绘制更完整的"糖密码"解码图谱。