比色法一步式逆转录环介导等温扩增技术快速特异性检测向日葵褪绿斑驳病毒

本研究针对泰国向日葵主要病毒病害向日葵褪绿斑驳病毒（SuCMoV），开发了一种基于比色法的一步式逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测技术。研究人员优化了反应条件（65°C 30分钟），通过颜色变化（粉红→黄）实现可视化判读，灵敏度达10 fg/μL，较RT-qPCR和RT-PCR提升10-1000倍，且能区分混合感染。该技术为田间快速诊断提供了无需复杂设备的解决方案。

　　

向日葵作为全球重要的油料作物，其生产正面临病毒病的严重威胁。在泰国，向日葵褪绿斑驳病毒（SuCMoV）已成为发病率最高的病原体之一，引发叶片褪绿斑驳、黄化及植株矮化等症状，造成重大经济损失。传统检测方法如RT-PCR和RT-qPCR虽可靠，但依赖昂贵仪器和电泳分析，难以在资源有限地区推广。更棘手的是，田间常出现SuCMoV与其他马铃薯Y病毒属（Potyvirus）成员的混合感染，现有技术难以快速区分。

针对这一难题，泰国农业大学植物病理学系的研究团队在《Crop Protection》发表了一项突破性研究。他们首次开发出基于比色法的一步式逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）技术，实现了对SuCMoV的快速、高灵敏特异性检测。这项技术仅需普通恒温器和肉眼观察，30分钟内即可完成从核酸扩增到结果判读的全流程，为田间病毒监测提供了革命性工具。

研究采用温室保存的SuCMoV感染向日葵叶片提取RNA，针对病毒外壳蛋白（CP）基因设计6条特异性引物（FIP/BIP/F3/B3/LF/LB）。通过温度梯度实验（60-70°C）和时间优化（15-45分钟），确定65°C 30分钟为最佳反应条件。灵敏度测试采用10倍系列稀释RNA（10⁰
-10^-8
），特异性验证则选用SuMV、SuMMoV等近缘病毒。自然感染样本检测与多重RT-PCR结果比对，证实方法的可靠性。

研究结果

LAMP引物设计
针对SuCMoV CP基因保守区设计的6条引物，在琼脂糖凝胶电泳中呈现典型梯状条带，比色系统显示阳性反应由粉红变黄。引物互补位点分析表明，其可覆盖病毒基因组8个特异区域。

RT-LAMP条件优化
15分钟反应未检测到产物，延长至30分钟时65°C组出现明显扩增，45分钟虽可提速但可能增加非特异风险。镁离子浓度（2-8 mM）和dNTPs（0.8-1.6 mM）测试确定最优试剂配比。

特异性与灵敏度
该技术仅对SuCMoV产生响应，与SuMV、TSV等无交叉反应。检测下限达10^-8
稀释度（10 fg/μL），比RT-qPCR（10^-7
）和RT-PCR（10^-5
）分别敏感10倍和1000倍。

自然样本验证
在23份田间样本中检出15份SuCMoV阳性，其中4例为SuCMoV/SuMV混合感染，结果与多重RT-PCR完全一致，证实方法对复杂样本的解析能力。

结论与意义
该研究首次建立的比色法RT-LAMP技术，通过以下创新点解决了行业痛点：1）将检测时间从常规方法的2-4小时缩短至30分钟；2）灵敏度提升3个数量级，可识别早期感染；3）闭管操作避免气溶胶污染；4）肉眼判读消除电泳需求。作者Kanungnit Reanwarakorn和Salit Supakitthanakorn特别指出，该方法适用于基层实验室和田间监测站，为东南亚向日葵病毒病防控提供了关键技术支撑。未来研究可进一步开发便携式设备联用方案，推动该技术在智慧农业中的应用。