超级增强子介导的环状RNA剪接环化多样性及其转录活性的表观调控机制研究

本研究揭示了H3K27ac标记的超级增强子(SE)通过双重调控机制显著增强环状RNA(circRNA)的剪接环化多样性和宿主基因转录激活。研究人员整合195个转录组数据，发现circRNA异构体减少伴随增强子缩短的肿瘤抑制特征(CIRSE)在肺腺癌中具有显著预后价值。通过纳米孔测序和CLIP-Seq技术，阐明了RNA结合蛋白对circRNA稳定性维持和反向剪接位点选择的双重调控作用，为肿瘤抑制性circRNA的发现提供了新范式。

　　

在非编码RNA研究领域，环状RNA(circRNA)作为一类共价闭合的单链RNA分子，近年来被发现参与多种生物学过程和疾病发生。然而，circRNA生物发生的表观遗传调控机制仍不清楚，特别是关于circRNA异构体多样性的调控网络及其在肿瘤中的作用亟待阐明。现有研究多聚焦于单个circRNA的功能分析，缺乏系统性筛选肿瘤驱动circRNA的方法，且对超级增强子(SE)这类关键表观遗传元件如何调控circRNA生物合成的认识存在空白。

北京大学基础医学院生物医学信息学系和血管稳态与重构国家重点实验室的研究团队联合广州国家实验室基础研究部，在《Nucleic Acids Research》发表了突破性研究成果。该研究通过整合多组学分析和技术创新，首次揭示了超级增强子通过双重机制调控circRNA剪接环化多样性的分子机制，并建立了基于表观遗传特征的肿瘤抑制性circRNA筛选新策略。

研究采用的关键技术包括：1) 整合195个ENCODE和GEO数据库的rRNA去除RNA-Seq数据集进行circRNA全景分析；2) 使用CIRIquant和CIRCexplorer3算法进行circRNA鉴定与定量；3) 纳米孔长读长测序解析circRNA全长序列；4) CLIP-Seq分析RNA结合蛋白(RBP)与反向剪接位点(BSJ)的相互作用；5) CRISPR干扰(CRISPRi)实验验证超级增强子的功能。

研究结果部分包含以下重要发现：

"SE-regulated genes tend to express diverse circRNA isoforms"：通过分析IMR-90细胞中1423个超级增强子和25,747个典型增强子(TE)，发现SE调控的宿主基因表现出更高的circRNA异构体数量和表达水平。这种关联独立于基因长度和表达量，且在纳米孔测序数据中得到验证。例如，G3BP1、DOCK10等SE基因产生大量circRNA异构体，而长度相近的DNAJC12等TE基因则circRNA多样性显著降低。

"SEs enhance circRNA diversity cross cell types"：在32种细胞系(17种癌细胞和15种正常细胞)的分析显示，SE宿主基因circRNA产生倾向性和异构体多样性具有跨细胞类型的保守性。研究发现H3K4me3和H3K36me3等激活型组蛋白修饰促进circRNA表达，而H3K27me3和H3K9me3等抑制型修饰则呈现相反效应。

"SE circRNAs show enriched BSJ-related RBP binding signal"：通过分析CLIPdb数据库的RBP结合数据，鉴定出101个显著偏好结合BSJ的RNA结合蛋白(如NUDT21、KHSRP)，这些蛋白在SE来源circRNA的BSJ区域结合信号更强。同时发现SE宿主基因具有更高的RNA聚合酶II(pol II)延伸速率，提示转录延伸效率可能参与调控circRNA多样性。

"Reduced splicing circularization diversity in CIRSE genes links to cancer progression"：泛癌分析发现肿瘤细胞中circRNA异构体数量普遍减少，其中4020个基因的circRNA多样性显著降低。通过建立"缩短增强子伴随circRNA异构体减少"(CIRSE)的肿瘤抑制特征，鉴定出98个CIRSE基因在血管生成、细胞迁移等癌症相关通路富集。单细胞RNA-Seq分析显示，乳腺癌和肾癌中肿瘤细胞的CIRSE评分显著低于正常细胞。

"CIRSE pattern acts as tumor suppressors in lung cancer"：在肺腺癌中，CIRSE基因的circRNA异构体数量与患者生存率显著相关。TCGA数据分析表明，低CIRSE评分的LUAD患者总体生存率更差(HR=0.62，P=0.008)，且晚期患者CIRSE评分显著降低。CIRSE circRNA在已报道的肿瘤抑制性circRNA中显著富集，如circ0001946(CDR1as)等。

"Structural instability of CIRSE circRNAs in tumors"：纳米孔测序揭示IMR-90(正常肺细胞)中CIRSE circRNA比A549(肺癌细胞)具有更稳定的二级结构和更低的最小自由能(MFE)。实验验证显示，正常细胞中CIRSE circRNA的半衰期更长，而肿瘤细胞中结构稳定性降低可能是其circRNA多样性减少的原因之一。

"CIRSE analysis for discovery of tumor-suppressive circRNAs"：基于上述发现建立的筛选流程鉴定出1551个候选肿瘤抑制性circRNA。实验验证显示，敲低10个随机选择的候选circRNA(如circ0001467)显著促进H1975细胞的增殖、迁移和侵袭能力，证实CIRSE特征的有效性。

该研究首次系统阐明了超级增强子通过调控RNA结合蛋白结合和转录延伸速率双重机制，影响circRNA剪接环化多样性和稳定性的分子机制。提出的CIRSE特征不仅为理解肿瘤表观遗传失调提供了新视角，还建立了不依赖突变信息的肿瘤抑制性circRNA发现新范式。研究所开发的整合表观遗传特征与circRNA异构体分析的筛选方法，为精准肿瘤学应用提供了重要工具，特别在缺乏驱动突变的肿瘤病例中具有独特价值。这些发现深化了对非编码RNA表观调控的认识，为开发基于circRNA的癌症诊断标志物和治疗靶点奠定了理论基础。