肺癌相关microRNA-3196中G-四链体结构的细胞调控机制及其治疗潜力

研究人员针对肺癌(LC)中miR-3196表达异常的问题，开展了pre-miR-3196中G-四链体(G4)结构的鉴定与调控研究。通过生物信息学预测结合多种生物物理技术证实了rG4-3196结构的存在，并利用分子解旋酶PhpC成功解旋该结构，使成熟miR-3196表达量提升1.9倍。该研究为通过靶向RNA G4调控miRNA生物合成治疗肺癌提供了新策略。

　　

在肺癌治疗领域，肿瘤抑制性microRNA(miRNA)的表达下调一直是困扰研究人员的难题。其中miR-3196作为重要的肿瘤抑制因子，能靶向调控SOX12、FOXP4和PUMA等致癌通路，但其在肺癌中表达显著降低。近年研究发现，约13-16%的前体miRNA(pre-miRNA)含有G-四链体(G-quadruplex，G4)形成序列，这些特殊结构可能通过与茎环结构竞争影响Dicer酶加工，从而调控成熟miRNA的产生。然而，如何精准调控这些RNA二级结构来恢复肿瘤抑制性miRNA的表达，仍是亟待解决的科学问题。

来自中国的研究团队在《International Journal of Biological Macromolecules》发表的研究中，系统探究了pre-miR-3196中G4结构的形成特性及其对miRNA生物合成的调控机制。研究采用生物信息学预测、圆二色谱(CD)、核磁共振(NMR)、荧光共振能量转移(FRET)等生物物理技术，结合细胞成像和RT-qPCR等分子生物学方法，全面解析了rG4-3196的结构特征及其生物学功能。

关键技术方法包括：1)使用QGRS-mapper和G4 Hunter算法预测pre-miR-3196中的G4形成序列；2)通过CD、UV-vis、NMR等技术进行体外结构表征；3)采用FRET竞争实验验证G4结构；4)利用荧光探针QUMA-1进行活细胞G4成像；5)使用分子解旋酶PhpC处理A549肺癌细胞，通过RT-qPCR检测成熟miR-3196表达变化。

研究结果部分：
3.1. Identification of PQSs in hsa pre-miR-3196
通过生物信息学分析在pre-miR-3196的5'端鉴定出一个高评分G4形成序列(G-score=39，G4H score=2.5)，该区域同时具有形成茎环结构的潜力，位于Dicer酶结合的关键位置。

3.2. In vitro characterization of hsa pre-miR-3196 G4
CD光谱显示rG4-3196在1mM KCl条件下即形成典型的平行G4结构(正峰265nm，负峰245nm)，熔解温度(T_m
)达54°C，在模拟细胞内环境(IMB)中仍保持稳定。热差异光谱(TDS)显示245nm和263nm特征正峰，进一步证实G4形成。核磁共振检测到10-12ppm区域的Hoogsteen氢键信号。非变性电泳和尺寸排阻色谱(SEC)表明该G4以单体构象为主(82%)。

3.3. PhpC interaction
荧光滴定实验显示PhpC与FAM标记的rG4-3196结合存在高(K_d
1=15.26nM)和低(K_d
2=4434nM)两种亲和位点。NMR显示PhpC能剂量依赖性解旋G4结构，导致Hoogsteen氢键信号消失。

3.4. In-cell studies of G4 formation
共聚焦显微镜观察显示转染的FAM-rG4-3196与G4探针QUMA-1高度共定位(Manders系数r=0.81)。PhpC处理使QUMA-1信号降低77%，同时使成熟miR-3196表达量提升1.9倍(50μM时)。对照实验显示该效应具有G4特异性：含G4的miR-let7e表达上调2.2倍，而无G4的miR-155不受影响。

研究结论与讨论：
该研究首次系统证实pre-miR-3196中存在功能性G4结构，并阐明其通过调控Dicer加工影响成熟miRNA产生的分子机制。创新性地采用分子解旋酶PhpC成功解旋细胞内的rG4-3196，恢复肿瘤抑制性miR-3196的表达，为肺癌治疗提供了全新策略。相较于传统的G4稳定剂(可能引起遗传不稳定性)，PhpC通过解旋G4发挥作用，具有更好的安全性。研究还建立了从生物信息学预测到细胞功能验证的完整研究体系，为其他疾病相关miRNA的G4调控研究提供了范式。未来需要进一步探索PhpC在动物模型中的治疗效果，并扩大研究至其他肺癌细胞类型，以推动该策略向临床转化。