Gβγ-SNARE相互作用介导突触小泡融合抑制的分子机制解析

研究人员针对G蛋白βγ亚基(Gβγ)如何特异性抑制神经递质释放这一关键问题，通过系统性肽段筛选技术，揭示了Gβγ通过N端卷曲螺旋结构域和β-螺旋桨结构域双重作用位点与SNARE复合物相互作用的分子机制。研究发现Gβ1γ2优先结合部分解链的前融合态SNARE构象，为理解GPCR调控突触传递的终末步骤提供了结构基础，对神经系统疾病药物开发具有重要指导意义。

　　

在神经系统中，突触小泡与质膜的精确融合是神经递质释放的关键步骤，这一过程由SNARE（可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体）复合物介导。然而，G蛋白偶联受体(GPCR)如何通过其βγ亚基(Gβγ)负向调控这一过程，长期以来存在两大谜团：不同Gβγ亚型对SNARE复合物的作用特异性从何而来？Gβγ究竟如何从分子层面阻断小泡融合？这些问题的解答对理解神经系统精细调控机制至关重要。

美国范德比尔特大学医学中心的研究团队在《Journal of Biological Chemistry》发表的研究中，创新性地采用肽段阵列扫描结合生物物理技术，首次绘制出人类全部Gβ和Gγ亚型与SNARE复合物的相互作用图谱。研究发现Gβγ通过其N端卷曲螺旋结构域和β-螺旋桨结构域形成双重结合界面，其中Gγ2亚型的N端肽段能有效竞争性抑制全长Gβ1γ2与SNAP25的结合。更引人注目的是，Gβ1γ2对部分解链的前融合态SNARE复合物表现出显著更高的亲和力，这为解释其在突触小泡释放准备阶段的抑制作用提供了直接证据。

研究主要运用了四大关键技术：1）覆盖人类全部Gβ(1-5)和Gγ(1-12)亚型的肽段阵列扫描技术；2）丙氨酸扫描突变结合远西方印迹分析；3）Alphascreen竞争结合实验定量相互作用强度；4）显微尺度热泳(MST)测定蛋白互作亲和力。这些技术的综合应用使研究人员能够从氨基酸分辨率解析蛋白互作界面。

【分子图谱揭示Gβγ-SNARE互作热点】通过系统筛查发现，Gβ1-4亚型均通过N端α螺旋(H1)、连接区(L1)以及β-螺旋桨的B1-B2和B6-B7叶片与tSNARE（靶SNARE）相互作用。关键的是，Gγ2亚型N端α螺旋的Arg13、Lys14等带正电残基对结合至关重要，这解释了为何Gβ1γ2比Gβ1γ1具有更强的SNARE抑制活性。

【关键残基的功能验证】丙氨酸扫描锁定Gβ1上19个关键残基，其中β-螺旋桨结构域的Arg96、Arg134等带正电残基突变导致结合显著减弱。意外发现Cys25和Asp303等残基突变反而增强结合，提示这些位点可能通过变构效应调控互作界面。

【构象特异性结合的发现】通过对比部分解链（K_D
=1.49μM）和完全解链（K_D

13μM）的SNARE复合物，首次证明Gβ1γ2优先识别前融合中间态。肽段阵列进一步显示Gγ2的C端环区(L1)在前融合态中结合增强，这与其抑制SNARE完全解链的功能高度吻合。

【纳米抗体的抑制作用】靶向Gβ1中心界面的纳米抗体Nb5能以25nM的IC₅₀
阻断Gβ1γ2-SNAP25相互作用，证实β-螺旋桨结构域是功能性结合位点。

这项研究通过多尺度技术手段，首次完整描绘了Gβγ-SNARE相互作用的分子图谱。研究提出的"双重位点抑制模型"认为：Gβγ一方面通过N端卷曲螺旋结构域插入SNARE束的C端，另一方面通过β-螺旋桨结构域阻碍synaptobrevin的整合，从而稳定前融合态并阻断完全解链。这一机制解释了为何Gβγ能特异性作用于已停泊和预激活的突触小泡，为开发靶向GPCR-SNARE通路的神经系统疾病治疗策略提供了精确的分子蓝图。特别是发现的不同Gγ亚型间的效能差异，为设计亚型选择性调节剂指明了方向。该研究将神经递质释放调控机制的认识推进到了原子分辨率水平，是突触信号转导领域的重要突破。