Komagataella phaffii酒精氧化酶1启动子5′-非翻译区替换策略缓解甘油抑制效应及其在重组蛋白生产中的应用

为解决Komagataella phaffii中酒精氧化酶1启动子（PAOX1 ）在甘油存在下的转录抑制问题，研究人员通过替换其5′非翻译区（5′ UTR）为甘油非敏感型PGAP 的UTR，构建杂交启动子PAOX1-UTR 。实验证实该改造可缓解混合碳源（甘油+甲醇）条件下的启动子抑制，并通过JASPAR预测及基因敲除验证了关键转录因子PAS_chr4_0626的调控作用。该研究为优化工业发酵中碳源协同利用提供了新策略。

　　

在生物制药领域，甲基营养型酵母Komagataella phaffii（原Pichia pastoris）凭借其强大的酒精氧化酶1启动子（P_AOX1
）系统，已成为重组蛋白生产的“明星细胞工厂”。然而这个系统存在一个致命短板——当培养基中存在甘油时，P_AOX1
会被强烈抑制，而甲醇单独作为碳源时又会导致细胞生长缓慢。这种“鱼与熊掌不可兼得”的困境，严重制约了工业发酵中高密度培养与高效表达的协同实现。

传统解决方案往往需要在生长阶段使用甘油、诱导阶段切换甲醇的“两步法”，但实际操作中碳源残留常导致表达效率打折。虽然前人尝试过敲除甘油代谢基因（如gut1、dak）或改造启动子核心区，但效果有限且机制不清。问题的核心在于：P_AOX1
的5′非翻译区（5′ UTR）这个“分子开关”如何在甘油环境下被“关闭”？上海科学技术大学等机构的研究人员独辟蹊径，通过合成生物学手段重构了这个调控模块，相关成果发表在《Journal of Biotechnology》。

研究团队采用三大关键技术：①启动子工程——将P_AOX1
的5′ UTR替换为组成型P_GAP
的UTR；②生物信息学预测——运用JASPAR软件分析UTR区转录因子结合位点；③基因编辑——通过CRISPR-Cas9敲除候选调控基因PAS_chr4_0626。以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因，在混合碳源（0.67-1%甘油+1%甲醇）条件下评估改造效果。

主要研究结果
Strains and chemicals
构建了重组菌株K. phaffii-AOX1（野生型启动子）和K. phaffii-UTR（杂交启动子），并验证了质粒系统的兼容性。

Recombinant K. phaffii strains cultivated by methanol and glycerol respectively
在纯甲醇培养中，野生型菌株的GFP荧光强度达3850.5 a.u.，而甘油条件下几乎无信号。杂交启动子菌株在混合碳源中展现出“双碳源兼容性”——当甘油浓度≤1%时，GFP表达量提升至纯甲醇条件的68%，且细胞密度提高1.4倍。

Conclusion
序列分析锁定PAS_chr4_0626编码的蛋白C4R8G1为关键抑制因子。其敲除株的P_AOX1
活性在甘油存在下恢复76%，效果与UTR替换相当，证实该蛋白通过结合5′ UTR介导抑制。

这项研究首次揭示5′ UTR在P_AOX1
碳源调控中的核心地位，突破了“甘油-甲醇”此消彼长的传统认知。所开发的UTR替换策略无需复杂代谢改造即可实现混合碳源高效表达，为工业化连续发酵提供了更经济的解决方案。未来通过定向进化UTR序列或可进一步优化调控精度，推动K. phaffii在合成生物学领域的更广泛应用。