亲和层析过程中单克隆抗体结构的实时监测：在线圆二色性与荧光技术的创新应用

本研究针对生物制药连续生产中实时监测单克隆抗体(mAb)构象变化的技术瓶颈，创新性地将在线圆二色性(CD)和荧光(F)技术整合至亲和层析系统。通过三组案例研究揭示了不同洗脱条件下mAb构象变化的动态特征，为优化层析工艺参数、预防蛋白错误折叠提供了新型过程分析技术(PAT)工具，对实现质量源于设计(QbD)的连续制造具有重要实践价值。

　　

在生物制药行业向连续生产模式转型的浪潮中，一个关键的技术瓶颈始终困扰着业界——如何实时监控蛋白质药物的结构完整性。单克隆抗体(mAb)作为生物药领域的"明星分子"，其复杂的空间构象直接决定着疗效与安全性。传统质量检测方法往往存在严重滞后性，当发现产品构象异常时，整批药物可能已经报废。特别是在亲和层析这个关键纯化步骤中，酸性洗脱条件就像一把"双刃剑"，虽能高效解离抗体，却可能引发不可逆的蛋白展开(Unfolding)和聚集(Aggregation)。这种工艺与质量的矛盾，正是英国伯明翰大学Formulation Engineering研究中心Charles Moore-Kelly团队试图破解的难题。

研究者们创造性地将实验室常用的圆二色性(Circular Dichroism, CD)和荧光(Fluorescence, F)光谱技术改造成在线监测系统，就像给层析柱装上了"构象显微镜"。他们选择HER2靶向的IgG1型单抗作为模型药物，利用其特有的近紫外CD负激子对(230-240 nm)和荧光特征峰作为结构探针。这套系统能在秒级时间尺度捕捉抗体分子二级、三级结构的细微变化，其灵敏度足以区分天然态(Native-state)与不同折叠中间体。研究团队通过三组精巧设计的对照实验，首次揭示了层析洗脱过程中抗体构象变化的动态全景图。

关键技术包括：(1)自主搭建的毛细管式在线CD/F检测系统，可兼容标准层析设备；(2)采用温度梯度洗脱技术实现等度中性pH条件下的温和解离；(3)基于近紫外CD激子分裂信号和色氨酸荧光位移的多参数构象分析。所有实验均使用Pall Life Sciences提供的10 mg/mL HER2单抗，通过透析法精确控制缓冲条件。

【mAb Stability at Low pH】章节揭示了令人警觉的发现：在Protein A层析的酸性洗脱过程中，滞后洗脱的抗体分子会出现比单纯酸孵育更严重的展开现象。CD谱图显示，这些"迟到者"的β-折叠含量显著降低，荧光发射峰红移达5 nm，提示色氨酸微环境极性增加。这表明层析介质表面可能存在局部pH梯度或空间位阻效应，加剧了蛋白不稳定性。

【Materials】部分详述的创新洗脱策略颇具启发性：在缓冲液中添加20%甘油后，CD信号显示抗体α-螺旋含量保留率提升15%；而采用37°C热洗脱替代传统低pH洗脱时，近紫外CD谱的负峰强度完全保留，证明该方法能完美维持抗体天然构象。这些发现为开发"构象友好型"纯化工艺提供了明确方向。

【Conclusions】部分的讨论深刻指出：传统层析监测仅关注纯度与收率，而CD/F揭示的"构象异质性"才是影响产品质量的关键。研究证实，即使在标准洗脱条件下，洗脱峰也可能包含从天然态到部分折叠体的连续构象谱系。这种在线监测技术不仅适用于亲和层析，还可扩展至病毒灭活、超滤浓缩等易引起蛋白应激的下游环节。

这项发表于《Journal of Chromatography A》的研究具有多重突破意义：技术上，首次实现层析过程中抗体高阶结构的实时解析；理论上，阐明洗脱动力学与构象变化的耦合机制；应用上，为连续生物制造提供了关键的PAT工具。正如通讯作者Owen R.T. Thomas强调的，该技术使"实时放行测试(RTRT)"成为可能，有望将传统数周的质量检测周期缩短至生产过程同步完成。对于正面临生物类似药(Biosimilar)价格压力的制药企业，这种能同时提升质量与效率的技术创新，或许将成为下一代生物药生产的标配解决方案。