聚焦pI标记物与载体两性电解质在icIEF-MS联用技术中对生物药蛋白变体表征的优化研究

为解决生物药开发中蛋白变体(proteoforms)精确表征的难题，研究人员系统评估了pI标记物和载体两性电解质(CAs)在成像毛细管等电聚焦-质谱联用(icIEF-MS)中的化学特性。通过单抗(mAb)模型揭示了试剂选择对方法准确性、MS兼容性和重复性的关键影响，为优化生物药质量分析提供了重要技术参考。

　　

在生物医药领域，蛋白质药物的复杂结构变异直接影响其疗效与安全性。这些被称为蛋白变体(proteoforms)的分子，源自基因多态性、选择性剪接和翻译后修饰(PTMs)，其电荷异质性对药物免疫原性和效价具有决定性作用。传统分析方法如离子交换色谱(IEX)和常规等电聚焦(IEF)已难以满足高分辨率检测需求，而新兴的成像毛细管等电聚焦(icIEF)与质谱(MS)联用技术虽展现出潜力，却面临pH梯度稳定性和质谱兼容性等关键挑战。

针对这一技术瓶颈，来自Advanced Electrophoresis Solutions的研究团队在《Journal of Chromatography B》发表重要成果。研究以单克隆抗体(mAb-ITM)为模型，首次系统评估了pI标记物(pI 8.40/9.99)和载体两性电解质(AESlyte? pH 8.0-10.5)对icIEF-MS分析性能的多维影响。通过整合纳米流压力驱动分离与毛细管直径转换技术(CDTT)，建立了不依赖化学 mobilization 的高效检测平台，解决了传统方法因焦耳热导致的pH梯度不稳定问题。

关键技术包括：1) 采用压力驱动纳米流传输分离蛋白变体；2) CDTT技术抑制谱带展宽；3) 优化含2% AESlyte? HR和10%甲酰胺的icIEF-MS工作液体系；4) 使用保留样本mAb-ITM进行方法验证。

化学试剂特性分析
质谱表征揭示pI标记物在m/z 200-2000范围内无干扰峰，而AESlyte? CAs呈现特征性低分子量分布，证实其与MS检测的兼容性。通过迁移时间稳定性测试，验证了pI 8.40/9.99标记物在三次重复中RSD<0.5%的优异重现性。

方法学验证
在mAb-ITM分析中，主峰(pI 9.02)与碱性变异体(pI 9.20/9.35)的分离度达1.2，证实AESlyte?可建立稳定的pH 8.5-10.5梯度。通过比较不同CA浓度发现，2%添加量在分离效率与MS信号强度间取得最佳平衡。

系统稳定性评估
毛细管涂层技术使电渗流(EOF)控制在<5×10^-9
m²
/V·s，配合30 cm×50 μm分离毛细管与20 cm×20 μm转移毛细管的CDTT组合，将分析时间缩短至15分钟且RSD<3%。

该研究创新性地建立了icIEF-MS试剂选择的科学框架：pI标记物需具备明确的质谱特征与迁移稳定性，而CAs应兼顾pH梯度形成能力与低质谱干扰。通过实现0.02 pI单位的分辨率，成功解析了传统方法难以区分的mAb去酰胺化变体。技术推广至抗体偶联药物(ADCs)和融合蛋白分析后，展现出跨分子类型的普适性，为生物药电荷变异体表征提供了标准化方案。

研究团队特别指出，该体系在乳制品功能蛋白分析中的成功应用，印证了其在非治疗领域的扩展价值。未来通过开发更广pH范围的CAs和稳定同位素标记的pI参照物，有望将检测灵敏度提升至亚微克级。这些突破不仅推动icIEF-MS成为生物药质量控制的黄金标准，更为蛋白质组学的深度研究开辟了新维度。