工程化肌红蛋白双突变体F46H/L49D构建金属结合位点实现多重催化功能

为拓展人工金属酶功能多样性，研究人员通过理性设计在肌红蛋白(Mb)螺旋C/D区引入F46H/L49D双突变，构建距离血红素铁约15??的金属结合位点。该突变体可结合Cu2+ /Mg2+ 等金属离子，展现出亚硝酸盐还原酶(NIR)、超氧化物歧化酶(SOD)及DNA切割活性（30分钟效率达100%），为构建非血红素/血红素双活性中心人工金属酶提供了新范式。

　　

在生命体系中，金属蛋白和金属酶通过整合金属离子作为辅因子，展现出电子传递、氧运输和催化等多样化功能。其中，血红素（铁-卟啉复合物）是众多蛋白质的关键活性中心。值得注意的是，天然血红素酶常通过整合Cu²⁺
或Fe²⁺
等额外金属离子拓展功能，如血红素-铜氧化酶(HCOs)利用Cu_B
-血红素中心催化氧还原为水，一氧化氮还原酶(NORs)则通过Fe_B
-血红素中心将NO转化为N₂
O。这种多功能性使血红素酶成为人工酶设计的理想模板。

然而，现有设计策略面临两大挑战：一是金属结合位点与血红素中心距离过远导致协同效应不足，如前期研究中R118H突变体Cu位点与血红素铁相距约20??；二是非共价修饰的金属结合位点稳定性欠佳。为突破这些限制，中南大学的研究团队在《Journal of Inorganic Biochemistry》发表研究，通过对肌红蛋白(Mb)进行F46H/L49D双突变，在螺旋C/D区构建新型金属结合位点，成功开发出具有多重催化功能的人工金属酶。

研究采用X射线晶体学、紫外-可见光谱和等温滴定量热法(ITC)等技术。突变体通过大肠杆菌BL21(DE3)表达系统制备，金属结合特性通过电子顺磁共振(EPR)和电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)验证，酶活检测包括亚硝酸盐还原动力学分析和质粒DNA切割实验。

【蛋白表达与纯化】
通过定点突变构建F46H/L49D Mb双突变体，表达纯化后获得高纯度蛋白。SDS-PAGE和质谱分析确认突变体分子量与理论值一致，圆二色谱显示其二级结构保持完整。

【金属结合位点设计】
晶体结构解析表明，突变形成的His46-His48-Asp49三联体构成金属结合位点，距离血红素铁15??。该位点可选择性结合Cu²⁺
（K_d
=2.3?μM）和Mg²⁺
（K_d
=0.8?mM），EPR谱图显示Cu²⁺
呈现典型type 2铜位点特征。

【多重催化功能】
Cu²⁺
结合态表现出显著NIR活性（k_cat
/K_m
=15.2?M^-1
s^-1
）和SOD活性（IC₅₀
=3.1?μM）。Mg²⁺
结合态则展现DNA水解切割能力，30分钟内完成超螺旋DNA的完全线性化，其活性依赖于Mg²⁺
浓度和pH值（最适pH=8.5）。

该研究开创性地在Mb中构建了兼具空间精确性和功能多样性的金属结合位点。通过精确控制金属位点与血红素中心的距离（15??），实现了金属离子依赖的可编程催化功能切换——Cu²⁺
赋予氧化还原酶活性，Mg²⁺
则启动水解酶功能。这种"一蛋白多催化"的设计策略突破了天然酶单一功能的限制，为开发环境响应型人工酶提供了新思路。特别值得注意的是，其DNA切割效率达到工业酶标准，在基因编辑工具开发领域具有应用潜力。研究由Ai-Qun Pan、Ying-Wu Lin等学者完成，工作获得国家自然科学基金支持，晶体数据采集于上海同步辐射装置。