整合离子交换色谱与成像毛细管等电聚焦联用高分辨质谱技术推动促红细胞生成素电荷异质性表征研究

本研究针对重组人促红细胞生成素(rhEPO)电荷异质性分析的瓶颈问题，创新性地将强阴离子交换色谱(SAX)与成像毛细管等电聚焦(icIEF)分别与高分辨质谱(MS)在线联用，成功鉴定出900+（SAX-MS）和600+（icIEF-MS）种组分，首次实现反向高压极性条件下的icIEF-MS分析，为生物类似药质量控制和兴奋剂检测提供了高灵敏度、高精度的解决方案。

　　

促红细胞生成素(EPO)作为治疗贫血的核心生物制剂，其复杂的糖基化修饰导致电荷异质性，直接影响药效与安全性。传统分析方法如毛细管电泳(CE)虽能快速分离电荷变异体，却无法提供结构信息。随着EPO专利到期和生物类似药崛起，开发能同时实现高效分离与精准鉴定的新技术成为行业迫切需求。

国家食品药品监督管理总局药品检定所的研究团队在《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》发表研究，通过整合强阴离子交换色谱-质谱(SAX-MS)和反向高压极性成像毛细管等电聚焦-质谱(icIEF-MS)两大技术平台，结合肽图分析，建立了rhEPO电荷变异体的全息表征体系。关键技术包括：1）优化SAX梯度洗脱条件实现9个峰分离；2）首创反向高压icIEF-MS联用技术解决正极模式下信号丢失难题；3）采用高分辨质谱(Q-Exactive^TM
)精确测定各组分分子量。

【Results and discussion】
SAX-MS分析：在pH 8.0的Tris-HCl体系中，rhEPO按唾液酸数目梯度分离为9个峰，质谱鉴定出含不同糖型（如四天线、三天线结构）的900+组分，揭示唾液酸含量与保留时间的线性关系。
icIEF-MS创新：常规正极模式无信号，反向极性（阴极进样）不仅获得UV检测的7个分离峰，还使MS信号强度提升3倍，证实pI 4.5-5.5区间的变异体主要为去唾液酸化产物。
交叉验证：通过分子量对齐，发现SAX分离的酸性组分对应icIEF的低pI组分，证实两种方法在唾液酸依赖性分离机制上的互补性。

【Conclusion】
该研究突破传统分离技术与质谱联用的壁垒，首次实现：1）单次分析获得电荷变异体的分离度、等电点(pI)和糖型结构多维数据；2）反向极性icIEF-MS新策略为酸性蛋白分析提供普适性方案；3）建立的900+组分数据库为生物药质量属性评估设立新标准。对于保障rhEPO生物类似药一致性评价及反兴奋剂检测具有里程碑意义，其技术框架可扩展至其他治疗性糖蛋白的表征研究。