基于计算与实验模型评估TPM1意义未明变异体的致病性：推动心肌病遗传筛查的精准医学突破

本研究针对心肌病遗传筛查中意义未明变异体(VUS)的临床困境，通过分子动力学模拟结合体外功能实验，系统评估20种TPM1 VUS的致病机制。发现A102D、D258E呈现肥厚型心肌病(HCM)样表型，K233N、A239T则表现为扩张型心肌病(DCM)特征，首次证实Tpm-TnI结合能可作为TPM1 VUS分类的关键预测指标，为建立可扩展的计算预测管道提供理论依据。

　　

在遗传性心肌病的临床诊断中，约半数患者携带的肌节蛋白基因变异被归类为"意义未明变异体"(VUS)，这些既不能确认致病性也无法排除风险的遗传变异，成为家族遗传筛查和临床干预的重大障碍。尤其对于编码肌钙蛋白(tropomyosin, Tpm)的TPM1基因，其变异既可导致肥厚型心肌病(HCM)也可引发扩张型心肌病(DCM)，但传统生物信息学工具如POLYPHEN-2和SIFT对这类变异的预测准确性欠佳。

为破解这一难题，研究人员聚焦TPM1基因的独特优势：其编码的Tpm蛋白结构相对简单且功能明确，具有典型的七肽重复(heptad repeat)序列，通过头尾聚合形成缠绕在肌动蛋白细丝表面的螺旋聚合物。既往研究发现，HCM和DCM相关突变可分布于所有七肽位点，仅凭变异位置无法预测表型。这促使研究团队开发结合计算模拟与体外验证的新策略。

研究首先对20个临床数据库中的TPM1错义突变进行分子动力学(MD)模拟，通过构建原子级Tpm模型，分析变异对蛋白质柔性、扭转及静电相互作用的影响。从中筛选出呈现极端分子特征的4个变异(A102D、D258E、K233N、A239T)进行功能验证。实验体系包含三个维度：体外运动性实验(IVMA)检测钙离子(Ca²⁺)敏感性变化，诱导多能干细胞(iPSC)分化的心肌细胞形态分析，以及腺病毒转导的工程化心脏组织(EHT)收缩功能测试。

关键技术包括：1) 基于Yamada冷冻电镜结构的Tpm分子动力学模拟，计算局部柔性(δ角)和扭转相位；2) 构建包含28个肌动蛋白、8个Tpm和4个肌钙蛋白T(TnT)的全细丝模型，分析B/C两种调控状态的相互作用能；3) 使用人iPSC来源心肌细胞与猪心肌脱细胞支架构建EHT；4) 等长收缩力测量系统记录峰值力、半松弛时间(RT50)等参数；5) 荧光标记肌动蛋白的IVMA定量细丝运动速度。

分子动力学筛选揭示关键分子特征
模拟显示A102D导致Tpm局部柔性显著增加(最大δ角差异9.5°)，K233N使B态稳定性降低最明显(-2150 kcal/mol)，D258E对Tpm-TnT相互作用能影响最大(C态-185 kcal/mol)，而A239T是唯一呈现过度扭转的变异(相位差+3.5°)。这些数据首次系统量化了TPM1变异对分子结构的差异化影响。

EHT实验验证功能表型
在EHT模型中，A102D表现出典型HCM特征：峰值力提升42%，RT50延长25%，相对力-时间积分(rFTI)增加19%，甚至超过HCM阳性对照E62Q。D258E则呈现轻度高收缩表型，RT50延长27%。而K233N和A239T显示DCM样表型，峰值力分别降低60%和83%，其中A239T的rFTI降幅达65%，超过DCM对照E54K。

钙敏感性改变驱动表型差异
IVMA证实A102D使钙敏感性(pCa₅₀)右移0.3单位，低钙时残留活性增加；A239T则使pCa₅₀左移0.4单位，最大激活速度降低35%。相关性分析显示rFTI与相对激活度(rAct)的相关系数达0.96，证实细丝水平变化直接决定组织收缩功能。

TnI结合能成为最佳预测指标
回顾性分析发现，所有体外参数中Tpm-TnI结合能变化(%ΔE_Tpm:TnI)最具预测价值：与rAct(r=0.91)、rFTI(r=0.89)均高度相关。A102D的全细丝模型显示其更易暴露肌球蛋白结合位点，而D258E通过延长侧链将Tpm推离actin-K326，从结构层面解释了功能变化。

这项研究开创性地证明，基于细丝结构的计算模型能准确预测TPM1 VUS的致病性，其中Tpm-TnI界面相互作用是决定表型的核心因素。A102D和D258E通过不同分子机制导致HCM样表型，前者增加细丝柔性破坏阻断态稳定性，后者削弱Tpm-TnT耦合；而K233N和A239T则分别通过降低B态稳定性和过度扭转引发DCM样改变。这些发现不仅为TPM1 VUS的临床分类提供了可量化的分子标志，更建立了从原子尺度到组织功能的完整研究范式。特别值得注意的是，虽然部分变异在临床数据库中偶见HCM报道，但功能实验明确显示其实际引发DCM样改变，提示现有临床分类可能存在误差，凸显功能验证的必要性。该成果发表于《The Journal of Precision Medicine: Health and Disease》，为心肌病精准诊疗提供了新的方法论框架。