MMACHC蛋白R161Q错义突变通过构象稳定性与维生素B12 结合活性缺陷导致cblC疾病的分子机制研究

本研究针对cblC型甲基丙二酸尿症伴同型半胱氨酸尿症的致病机制，聚焦MMACHC蛋白常见错义突变R161Q，通过生物物理技术揭示该突变导致蛋白构象稳定性降低、热解折叠路径改变及腺苷钴胺素(AdoCbl)结合能力受损。研究发现突变体二聚化能力显著减弱，而渗透剂甜菜碱可部分恢复其稳定性与功能，为开发基于蛋白质稳定的治疗策略提供新思路。

　　

维生素B₁₂
（钴胺素，Cbl）代谢缺陷导致的cblC型甲基丙二酸尿症伴同型半胱氨酸尿症是一种罕见的遗传代谢病，患者常表现为心血管功能障碍、智力残疾和严重黄斑病变。MMACHC蛋白作为Cbl代谢的核心酶，负责将不同形式的Cbl转化为活性辅因子腺苷钴胺素(AdoCbl)和甲基钴胺素(MeCbl)。尽管已有超过60种MMACHC基因突变被报道，但R161Q作为最常见的错义突变，其致病机制尚未完全阐明。这项发表在《Molecular Genetics and Metabolism》的研究，通过多学科交叉方法揭示了R161Q突变如何通过破坏蛋白构象稳态引发疾病。

研究团队综合运用差示扫描量热法(DSC)、圆二色谱(CD)、等温滴定量热法(ITC)、分子动力学(MD)模拟、动态光散射(DLS)和小角X射线散射(SAXS)等技术。通过比较野生型与突变体蛋白的热力学参数、寡聚状态和配体结合特性，结合渗透剂处理实验评估功能恢复效果。

3.1 R161Q突变对MMACHC稳定性的影响
DSC分析首次揭示MMACHC-WT存在两个热解折叠过渡态（T_m1
=39.2°C，T_m2
=48.6°C），而R161Q突变导致第二个过渡态显著不稳定（T_m2
降至42.1°C）。分子动力学模拟显示突变体在温度跃迁后RMSD值升高15?，证实其三级结构稳定性受损。

3.2 R161Q突变对MMACHC结构的效应
SAXS测定显示突变体回转半径(R_g
)从3.2nm增至3.7nm，Kratky图谱表明其构象柔韧性增加。DLS检测发现突变体流体力学半径(R_h
)扩大12%，提示可能存在局部解折叠或聚集倾向。

3.3 R161Q突变对底物结合的影响
ITC定量测定显示突变体对AdoCbl的亲和力降低7倍（K_d
从15nM增至104nM），且完全丧失与谷胱甘肽(GSH)的结合能力。值得注意的是，AdoCbl结合可诱导WT蛋白形成GSH结合活性构象，但该变构效应在突变体中消失。

3.4 R161Q突变对蛋白寡聚化的作用
蓝 native电泳和尺寸排阻色谱证实：AdoCbl可使WT蛋白二聚体比例提升至50%，而突变体仅形成3%的二聚体。静态光散射测得WT-AdoCbl复合物分子量达58.09kDa（接近二聚体理论值），突变体则维持在单体状态（43.1kDa）。

3.5 甜菜碱对R161Q的稳定作用
等温变性实验发现0.5M甜菜碱能显著延缓突变体解折叠。功能恢复实验显示甜菜碱处理使突变体的脱烷基活性提升3.3倍（k_obs
从0.0020增至0.0066 min^-1
），证实稳定蛋白构象可部分挽救酶活缺陷。

这项研究首次系统阐释了MMACHC-R161Q突变通过多重机制导致功能缺陷：①破坏热力学稳定性使中间态积累；②变构调控失效导致GSH结合位点无法暴露；③二聚化障碍影响功能性寡聚体形成。特别重要的是，发现临床常用药物甜菜碱具有分子伴侣样作用，这为开发"构象修复"疗法提供了直接证据。未来针对cblC的治疗策略可能需要联合传统代谢干预与蛋白质稳定剂，该研究为精准治疗路径的设计奠定了理论基础。