脑脊液UBE3A蛋白检测新方法助力Angelman综合征诊疗研究

研究人员针对Angelman综合征(AS)患者脑脊液(CSF)中UBE3A蛋白难以检测的难题，开发了结合免疫沉淀(IP)与高分辨质谱(LC-MS)的定量检测技术。该方法灵敏度达2.5 pg/mL，首次证实健康人CSF中UBE3A水平(24.76±6.75 pg/mL)显著高于AS患者(5.30-5.59 pg/mL)，为AS的机制研究与治疗开发提供了关键工具。

　　

Angelman综合征(AS)是一种罕见的神经发育障碍，患者表现为智力障碍、癫痫和特征性"快乐木偶"行为，其根源在于神经元中母源UBE3A蛋白的缺失。尽管已知UBE3A基因(位于15q11.2-q13)的印记机制导致父源等位基因在神经元中被UBE3A-ATS转录本沉默，但长期以来缺乏灵敏方法检测中枢神经系统中的UBE3A蛋白水平，严重阻碍了靶向治疗开发。目前进入临床试验的三种反义寡核苷酸(ASO)疗法试图激活父源UBE3A表达，但缺乏可靠的药效学生物标志物评估工具。

为突破这一技术瓶颈，来自美国研究团队开发了创新性的免疫沉淀-液相色谱质谱(IP-LC-MS)检测方法。该研究首先在HEK293细胞和诱导多能干细胞(iPSC)来源神经元中验证方法特异性，随后应用于14名健康成人和29名AS患者的CSF样本分析。

关键技术包括：1) 使用生物素化单克隆抗体进行UBE3A免疫沉淀；2) 胰蛋白酶消化后通过高分辨质谱检测特异性肽段；3) 采用¹⁵
N标记重组蛋白作为内标；4) 分析验证涵盖灵敏度(LLOQ 2.5 pg/mL)、精密度和准确度；5) 样本来自美国多中心观察研究(NCT04103333)和以色列自然史研究队列。

【免疫沉淀(IP)】
通过生物素化3E5单克隆抗体与链霉亲和素磁珠结合，从500 μL CSF中捕获UBE3A，结合¹⁵
N标记内标实现绝对定量。

【HEK293细胞与iPSC神经元验证】
shRNA敲低实验显示IP-LC-MS与Western blot结果高度一致。AS患者iPSC神经元的UBE3A水平仅为对照组的20%，证实方法可检测内源性表达差异。

【AS患者CSF分析】
健康对照组UBE3A浓度(24.76±6.75 pg/mL)显著高于两个独立AS队列(5.30±0.42 pg/mL和5.59±0.40 pg/mL)，且不同基因型(缺失/突变)患者间无差异，提示检测可稳定反映病理特征。

【讨论与结论】
该研究首次建立可定量CSF UBE3A的超灵敏方法，其检测下限较传统技术提升两个数量级。发现AS患者CSF UBE3A约为健康人群的1/5，为AS诊断和ASO疗法疗效评估提供了首个可量化的中枢生物标志物。值得注意的是，不同基因型患者间UBE3A水平无差异，支持神经元UBE3A缺失是AS共同病理基础。该方法已成功应用于两项国际多中心研究，未来将推动AS精准医疗发展。

论文由Omar S. Mabrouk等合作完成，发表于《Molecular Genetics and Metabolism》，通讯作者包含AS研究权威Elizabeth Berry-Kravis。研究获得Biogen、Ionis和Roche等企业支持，体现了产学研合作在罕见病研究中的重要性。