组氨酸200构象灵活性揭示碳酸酐酶II T200H突变体保留催化活性的分子机制

本研究针对碳酸酐酶II(CAII)关键活性位点残基Thr200突变后仍保留部分催化活性的机制难题，通过高压冷冻X射线晶体学技术捕获T200H突变体在不同CO2 压力(0/5/20 atm)下的三种催化中间态结构。研究发现His200通过构象动态变化实现"分子门控"功能：在"闭合"态阻断质子传递网络(W1-W2)，而在"开放"态恢复水分子网络并允许底物CO2 进入，这解释了突变体保留60%催化效率(kcat /KM )的结构基础，为设计可调控的CA变体提供了新思路。

　　

碳酸酐酶(CA)是自然界最高效的催化剂之一，其II型亚型(CAII)每秒可催化百万次CO₂
水合反应，在pH调节和CO₂
运输中起核心作用。这种惊人的催化效率依赖于精密的活性中心结构：一个Zn²⁺
离子与三个组氨酸(His94/96/119)配位，周围环绕着氢键水分子网络。其中Thr200通过稳定关键水分子W1和W2，在维持质子传递网络中扮演关键角色。然而令人困惑的是，当Thr200被组氨酸取代(T200H突变)后，CAII仍保留显著活性——这违背了传统酶学认知，因为庞大的组氨酸侧链理应严重阻碍活性中心功能。

为破解这一谜题，研究人员采用高压冷冻X射线晶体学这一前沿技术，在0、5和20 atm CO₂
压力下分别捕获了T200H突变体的三种状态：无配体静息态(T200H-0atm)、产物结合态(T200H-5atm)和底物结合态(T200H-20atm)。通过1.23-1.29 ?高分辨率结构解析，结合各状态下的水分子网络分析和动力学参数比较，揭示了His200的动态构象变化如何协调催化过程。

关键实验方法
研究采用重组表达纯化野生型和T200H突变型CAII蛋白，通过悬滴蒸汽扩散法获得晶体。利用高压冷冻装置在0/5/20 atm CO₂
压力下处理晶体后，在韩国浦项光源7A线站收集X射线衍射数据。使用分子置换法解析结构，经多轮精修获得原子分辨率结构模型，重点分析活性中心水分子排布和His200构象变化。

T200H-0atm结构：活性中心受阻的无配体状态
静息态结构显示，His200的咪唑环深入活性中心，其N_ε2
原子与W1位置仅距1.4 ?，直接导致W1和W2水分子缺失，完全破坏质子传递网络(W_Zn
-W1-W2-His64)。His64被迫采取"向外"构象，入口通道(EC)水分子也发生位移。这表明在无底物时，His200像"门栓"般阻断活性中心。

T200H-5atm结构：产物结合的阻塞状态
在5 atm CO₂
下，His200仍保持阻塞构象，但令人惊讶的是活性中心清晰可见碳酸氢根(HCO₃
^-
)结合。产物以假双齿模式配位Zn²⁺
，其O3原子与His200的C_δ1
形成范德华接触。该发现证明即使His200阻塞活性中心，CO₂
仍能突破障碍完成催化转化，暗示His200存在动态开放瞬间。

T200H-20atm结构：底物结合的开放状态
20 atm CO₂
压力下的结构出现戏剧性变化：His200咪唑环翻转102°，形成"开放"构象。这种构象使N_δ1
与W1(3.23 ?)、W2(3.40 ?)形成新的氢键，完全恢复质子传递网络。入口通道水分子重排有序化，底物CO₂
占据疏水口袋中原W_DW
位置，其碳原子距Zn²⁺
-OH^-
仅2.70 ?，处于理想的亲核攻击距离。

讨论与意义
这项研究首次阐明CAII中残基构象动态性对催化的调控机制：His200通过"闭合-开放"构象转换，像分子门控般分阶段调控底物进入、催化转化和产物释放。这种动态性解释了为何T200H突变体保留60%催化效率(k_cat
/K_M
)和25%转换数(k_cat
)。更引人注目的是，天然含有His200的人源CAI同工酶也采用类似机制，但其构象开放程度更低，导致活性仅为CAII的10%。

该发现突破了传统酶学静态结构认知，揭示通过关键残基的构象工程可精准调控酶活性。这为设计环境响应型CA变体开辟新途径——例如可开发pH或CO₂
浓度依赖的"智能"酶，在工业碳捕获或医疗缓释系统中应用。研究也提示类似门控机制可能存在于其他金属酶中，为酶工程领域提供了全新设计范式。论文发表于《Molecules and Cells》，其高分辨率结构数据已存入PDB(登录号9JWE/9JWU/9U5B/9JWW)。