无细胞多酶级联反应高效合成UDP-GalNAc：糖生物技术领域成本瓶颈的突破性解决方案

本研究针对糖基化修饰关键底物UDP-N-乙酰半乳糖胺(UDP-GalNAc)合成成本高昂的难题，通过构建包含UDK、NAHK等6种重组酶的无细胞多酶级联系统，结合两轮实验设计(DoE)优化反应参数，实现从廉价底物尿苷(Uri)和GalNAc出发的95%转化率与28 g/L产量，为糖类药物规模化生产提供经济高效的生物合成路径。

　　

在糖生物学领域，UDP-N-乙酰半乳糖胺(UDP-GalNAc)作为O-连接糖和糖胺聚糖(GAGs)合成的核心前体，其高昂的市场价格严重制约了糖基化药物的研发与应用。传统动物组织提取法面临生态伦理、批次差异等问题，而现有酶法合成又受限于底物成本与转化效率。针对这一瓶颈，研究人员开发了基于廉价底物的无细胞多酶级联合成策略。

研究团队通过整合六种重组酶（尿苷激酶UDK、N-乙酰己糖胺1-激酶NAHK、尿苷单磷酸激酶UMPK等），构建了从尿苷(Uri)和GalNAc合成UDP-GalNAc的级联反应路径，创新性地采用聚磷酸盐(PolyP_n
)实现ATP原位再生。通过两阶段实验设计(DoE)系统优化pH、温度、MgCl₂
等参数，最终将转化率从初始5%提升至95%，产物滴度达46.1 mM（28 g/L），较文献报道最高水平提升19倍。阴离子交换色谱纯化获得89%回收率与90%纯度，为工业化生产奠定基础。

关键技术包括：1）多酶级联系统构建与重组蛋白表达纯化；2）基于MODDE?软件的DoE参数优化；3）高效液相色谱(HPAEC)与³¹
P NMR产物分析；4）阴离子交换色谱纯化工艺开发。

【研究结果】
3.1 蛋白纯化：所有酶经IMAC纯化后纯度>95%（SDS-PAGE验证）
3.2 概念验证：比较GLMU与GALU两种尿苷转移酶，前者实现1.1 mM UDP-GalNAc的完全转化
3.3 底物优化：50 mM底物浓度下单轮DoE使产量提升14倍至36.8 mM
3.4 参数优化：二次DoE确定0.5 mM ATP/32 mM PolyP_n
/120 mM MgCl_{2>为最佳组合
3.5 纯化工艺：HiTrap Q HP柱实现93 μg产物回收，90%纯度级分占33%}

【结论与意义】
该研究通过智能算法驱动的多参数优化，突破了多酶级联反应效率瓶颈。所建立的合成路径具有三大优势：1）原料成本降低90%以上；2）28 g/L滴度满足工业化需求；3) 模块化设计可拓展至其他核苷糖合成。特别值得注意的是，PPK3介导的PolyP_n
-ATP再生系统与Mg²⁺
螯合效应的平衡控制，为类似多酶体系提供了优化范式。该成果发表于《New Biotechnology》，为糖类药物（如抗凝肝素、抗癌糖肽）的规模化生产扫清了关键原料障碍，同时为复杂生物催化系统的理性设计提供了方法论参考。