工程化恶臭假单胞菌直接合成聚羟基脂肪酸酯共混物的创新策略及其性能调控研究

本研究针对传统聚羟基脂肪酸酯(PHA)共混物需后合成混合的瓶颈问题，通过工程化改造恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，引入Cupriavidus necator的phaCAB操纵子，首次实现通过启动子选择直接调控P(3HB)/mcl-PHA共混物组成(3HB含量17.9-99.6 mol%)。该工作开发了微生物一步法合成可定制PHA共混物的新范式，最高产量达1.48 g/L，为生物基材料的高效制备提供了创新解决方案。

　　

在塑料污染日益严重的今天，寻找可替代石油基塑料的生物降解材料成为当务之急。聚羟基脂肪酸酯(PHA)作为微生物合成的天然聚酯，因其优异的生物相容性和可降解性备受关注。然而传统PHA材料存在机械性能单一的问题，通常需要通过后合成的熔融共混来改善性能，这种方法不仅步骤繁琐，还可能导致材料降解。更棘手的是，自然界中能同时合成短链(scl-PHA)和中链(mcl-PHA)的菌株极为罕见，目前仅发现Pseudomonas umsongensis GO16等极少数菌株具备这种能力。

针对这些挑战，研究人员开展了一项创新性研究，成果发表在《New Biotechnology》上。该研究首次在恶臭假单胞菌(P. putida)中实现了P(3HB)/mcl-PHA共混物的直接微生物合成，并通过启动子工程精确调控共混比例。选择P. putida作为宿主具有多重优势：其天然产生mcl-PHA的能力、强大的代谢网络、快速生长特性以及工业生产的适用性。

研究采用分子克隆构建含不同启动子的表达载体，通过电转化导入P. putida mt-2。使用气相色谱(GC)分析PHA组成，凝胶渗透色谱(GPC)测定分子量，扩散排序谱(DOSY)和核磁共振(NMR)验证共混物特性，差示扫描量热法(DSC)和热重分析(TGA)表征热性能。特别设计了启动子强度测试系统，比较了ParaB、PrhaB等诱导型启动子和PphaC1等组成型启动子的表达效率。

研究结果部分，"P. putida中诱导型和组成型启动子的活性"显示，ParaB启动子诱导后表达强度最高，而PphaC1组成型启动子活性最低但表达稳定。"PHA共混物组成受启动子选择调控"部分发现，即使未诱导的ParaB和PrhaB也能产生含17.9-41.5 mol% 3HB的共混物，而PphaC1控制的菌株则产生高3HB含量(89.7-93.0 mol%)的共混物。"PHA共混物的分子量差异"通过GPC和DOSY证实，P(3HB)分子量(298.3-502.2 kg/mol)显著高于mcl-PHA(71.5 kg/mol)，且两者扩散系数不同，确认为物理共混而非共聚物。

在"热性能分析"中，DSC显示所有样品在163-175°C出现P(3HB)的熔融峰，而mcl-PHA仅在43.7°C有微弱熔融信号。特别值得注意的是，工程菌能以马铃薯皮水解物为碳源生产PHA，在无额外营养添加时PHA含量达24.6 wt% CDW，验证了废弃生物质利用的可行性。

这项研究的突破性在于：首次实现了通过启动子选择调控微生物合成PHA共混物的组成；建立了P. putida中4种新组成型启动子的活性数据；揭示了P(3HB)与mcl-PHA合成途径的代谢竞争关系；开发了基于废弃生物质的一步法共混物生产工艺。相比传统熔融共混法，微生物直接合成避免了高温加工导致的聚合物降解，保持了材料完整性。研究不仅为定制化生物材料生产提供了新思路，其构建的工程菌株和启动子工具箱也可推广至其他PHA生产菌株的改造，对推动生物基材料的产业化应用具有重要意义。未来通过优化发酵工艺和采用更强的启动子，有望进一步提高共混物的产量和性能。