基于MutS介导的快速低成本体外DNA合成纠错技术开发与应用

针对体外DNA合成过程中不可避免的碱基错误问题，天津合成生物创新团队开发了基于热稳定MutS蛋白的旋转柱纠错系统。研究通过筛选11种MutS变体，发现TaMutS/TtMutS具有优异错配识别能力，结合自研纤维素旋转柱技术，将纠错成本降至0.032美元/反应，反应时间缩短至20分钟，错误率降低2.15-8.17倍，为合成生物学提供了高效经济的DNA质量控制方案。

　　

在合成生物学迅猛发展的今天，DNA合成技术已成为构建人工生命系统的基石。然而，化学法合成DNA过程中，由于偶联效率限制和副反应影响，不可避免地会产生碱基插入、缺失或错配等错误。这些"分子打字错误"不仅增加了基因合成成本（全球基因合成市场规模预计2030年达57.8亿美元），更严重制约了合成基因组、数据存储DNA等前沿领域的发展。传统纠错方法如高效液相色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)虽能去除截短序列，但对单碱基错误的校正效率有限，且存在操作繁琐、设备依赖性强等缺陷。

针对这一技术瓶颈，天津合成生物创新团队在《New Biotechnology》发表重要研究成果。研究聚焦DNA错配修复系统核心蛋白MutS，通过系统性比较11种微生物来源MutS的纠错性能，创新性地开发出"旋转柱-纤维素-MutS"三位一体的快速纠错技术。该技术将反应体积压缩至10μL级，单次反应成本仅0.032美元，在20分钟内即可完成高质量DNA纠错，为合成生物学提供了革命性的分子质控工具。

关键技术方法包括：1) 构建11种Cbm3-Egfp-MutS融合表达系统；2) 通过天然PAGE和表面等离子共振(SPR)定量分析MutS与12种单碱基错误的结合特性；3) 开发基于无定形纤维素(AC)的微型旋转柱装置；4) 采用二代测序评估对Cas12f和EGFP基因的纠错效率。

研究结果揭示三大重要发现：

"不同MutS对DNA错配的结合能力存在显著差异"
通过凝胶迁移实验发现，EcMutS、TaMutS、TtMutS等5种蛋白能特异性识别错误DNA，而BsMutS等3种蛋白完全丧失结合能力。特别值得注意的是，来自嗜热菌的TaMutS和TtMutS在50℃处理2小时后仍保持稳定活性，为常温运输储存提供了可能。

"MutS存在明显的错配结合偏好性"
SPR定量分析显示，EcMutS对+A和G:T错配亲和力最强(K_d
=11.75-13.10nM)，而TaMutS更擅长识别+G/+A/+T插入缺失(K_d
=15.40-16.05nM)。这种"分子指纹"特性提示组合使用可覆盖更广谱的错误类型。

"旋转柱系统实现低成本高效纠错"
自研装置将传统MICC方法的反应体积从240μL降至10μL，成本降低90%。对717bp EGFP基因的纠错实验表明，经过两轮处理可将错误率从2.32/kb降至0.45/kb，完美片段比例从18.37%提升至78.05%。尤为关键的是，TaMutS/TtMutS组合使351bp片段的插入缺失错误率降至0.04/kb，显著优于单一MutS效果。

这项研究在理论和应用层面均取得突破：首次系统阐明了不同MutS对12类单碱基错误的定量结合规律，为理性设计纠错系统奠定基础；开发的旋转柱技术将操作时间从小时级缩短至分钟级，成本达到商业化酶的1/250。更重要的是，该技术特别适合处理芯片合成获得的低成本寡核苷酸，有望大幅降低合成生物学研究门槛。

论文最后指出，未来可通过定向进化获得T:C错配高亲和力突变体，或与核酸酶纠错(EMC)方法联用，进一步攻克顽固性错误。这项来自中国研究团队的原创成果，为DNA合成质量控制提供了具有自主知识产权的"中国方案"，对推动合成生物学工具国产化具有重要意义。