荧光标记聚己二酸丁二醇酯(PBA)水解微生物的高通量筛选方法及其应用

为解决塑料污染中合成聚合物高效降解酶的筛选难题，研究人员开发了一种基于5-羧基荧光素(5-FAM)标记聚己二酸丁二醇酯(PBA)的高通量荧光检测平台。该研究通过共价偶联荧光标记物与PBA，结合FT-IR、HPLC等技术验证了Thermobifida cellulosilytica来源的Thc_Cut1角质酶对PBA的水解活性，并在Pichia pastoris表达体系及Fusarium solani等真菌中实现复杂基质下的活性检测。该方法为环境微生物资源挖掘和酶工程提供了灵敏、特异的筛选工具。

　　

塑料污染已成为全球性环境挑战，每年超过4亿吨的塑料产量中，聚酯类材料因含有可水解的酯键而成为生物降解的重点目标。然而，传统检测方法如HPLC虽能准确量化单体产物，却难以适应高通量筛选需求；而基于浊度或清除圈的方法又易受基质干扰。针对这一技术瓶颈，研究人员开发了新型荧光标记策略，为挖掘环境微生物中的降解酶资源提供解决方案。

研究团队通过Steglich酯化法将5-FAM共价连接到PBA骨架上，制备了荧光标记率为1%、5%和10%的混合材料。关键技术包括：(1)FT-IR和HPLC验证酶解产物；(2)96孔板荧光读数系统(激发485 nm/发射530 nm)；(3)重组表达体系采用Pichia pastoris KM71H分泌Thc_Cut1；(4)以Fusarium solani和Alternaria alternata天然菌株作为复杂基质模型。

在"酶解聚(1,4-丁二醇己二酸酯)"部分，研究证实Thc_Cut1在24小时内可释放30 mM己二酸和40 mM 1,4-丁二醇，FT-IR显示1720 cm^-1
酯键特征峰衰减，实测重量损失(40%)远超理论计算值(25%)，表明存在寡聚体中间产物。"5-FAM标记PBA合成"中，GPC显示标记后聚合物分子量(M_n
≈2000 Da)与商业PBA相近，证实标记过程未显著改变聚合物结构。

"荧光标记PBA的酶解"实验显示，10%标记样品经Thc_Cut1处理6小时后荧光强度达4000 RFU，较空白组(500 RFU)显著提升。在生物体系中，重组P. pastoris培养液产生500 RFU信号，而Fusarium solani天然分泌酶达1328 RFU，对应pNPB酯酶活性4.9±0.2 mU/mL。值得注意的是，1%标记浓度已可检测到400 RFU变化，证明该方法具备高灵敏度。

该研究创新性地将荧光标记与聚合物降解检测相结合，克服了传统方法在复杂基质中的局限性。通过共价连接策略避免了小分子荧光探针的浸出问题，且信号强度与酶解程度呈正相关。这一技术为从环境样本中快速筛选聚酯降解微生物及酶突变体库提供了标准化平台，对推动塑料生物循环经济具有重要意义。论文发表于《New Biotechnology》，为环境生物技术领域提供了新的方法论参考。