基于泵浦-探测光声光谱与成像技术解析荧光蛋白光物理特性的创新研究

本研究针对传统多波长成像和线性解混方法在活体应用中面临的背景信号干扰和光谱失真问题，创新性地采用泵浦-探测光声（PA）技术，通过扫描泵浦波长、探测波长及时间延迟，成功获取了红色荧光蛋白（Katushka、mNeptune、mCardinal）的特异性光谱特征和寿命信息，实现了高对比度多路成像，为活体生物传感和微环境监测提供了新工具。

　　

在生物医学成像领域，分子光声（或光热）成像技术因其结合了光学的高对比度和超声的高分辨率优势，成为研究热点。然而，传统多波长成像方法在活体应用中面临巨大挑战：外源性对比剂在靶组织积累弱，导致图像对比度低；血红蛋白等内源性色素的背景信号干扰严重；组织光传输导致光谱和结构失真，使得浓度与PA信号强度的线性关系失效。这些问题严重制约了活体分子成像的灵敏度和特异性。

为解决这些难题，来自马丁路德大学的研究团队在《Photoacoustics》发表了一项创新研究，通过泵浦-探测激发技术，系统探究了红色荧光蛋白的光物理特性。研究人员采用三种方法：固定探测波长扫描泵浦波长、固定泵浦波长扫描探测波长、以及调节泵浦-探测脉冲时间延迟，成功克服了传统方法的局限性。

关键技术方法包括：1）双光学参量振荡器（OPO）激光系统生成可精确控制时间延迟的泵浦和探测脉冲；2）定制光声光谱系统测量纯化荧光蛋白溶液的时间分辨信号；3）基于背投影算法的光声断层成像系统获取二维差异图像；4）线性解混算法从差异图像光谱中恢复蛋白质相对浓度。实验样本为基因表达的大肠杆菌产生的红色荧光蛋白Katushka、mNeptune和mCardinal。

研究结果部分：
泵浦波长扫描显示，差异信号光谱与吸收光谱在580-650 nm范围内定性一致，成功区分了Katushka的20 nm蓝移特征（图4a-c）。
探测波长扫描表明，在避免光谱重叠区域时，差异信号与发射光谱吻合，且具有蛋白特异性特征（图4d-f）。
时间延迟测量发现，当泵浦和探测波长位于吸收-发射重叠区时，差异信号的时间依赖性呈现蛋白特异性变化（图5b）。
与传统单脉冲激发相比，泵浦-探测光谱表现出更强的鲁棒性和更小的光通量依赖性（图6）。
光声断层成像实验成功从含非荧光吸收剂的体模中恢复了Katushka和mNeptune的空间分布，噪声等效浓度（NEC）达0.50-0.62 μM（图7）。

研究结论指出，泵浦-探测成像结合多参数扫描可选择性显示荧光蛋白贡献，抑制内源性色素干扰。差异光谱受光通量影响小，显著提高了多路成像的灵敏度和特异性。该方法为监测pH值、离子浓度等微环境参数变化提供了新思路，在蛋白质聚集可视化、ATP浓度成像、细胞衰老监测等领域具有重要应用前景。特别值得注意的是，通过合理设计荧光探针，利用吸收-发射光谱重叠区的光学串扰，可进一步提高基于时间延迟成像的检测灵敏度。这项研究为发展下一代分子影像技术和生物传感器奠定了重要基础。