基于重组酶聚合酶扩增技术(RPA)的水稻根结线虫Meloidogyne graminicola快速检测及M. oryzae筛查方法的建立

针对水稻根结线虫(Meloidogyne graminicola, Mg)传统检测方法耗时、依赖实验室设备的问题，葡萄牙国家农业与兽医研究所团队开发了基于重组酶聚合酶扩增(RPA)的现场检测技术。该研究通过优化SCAR标记靶向的RPA体系，实现8分钟内从J2幼虫粗提物中特异性检出单个Mg个体(灵敏度1:9混合种群)，并首次实现M. oryzae的延迟扩增筛查。这项发表于《Physiological and Molecular Plant Pathology》的成果为水稻线虫病的早期防控提供了革命性工具。

　　

水稻作为全球第三大粮食作物，其生产正面临植物寄生线虫(PPN)的严重威胁。其中，水稻根结线虫(Meloidogyne graminicola, Mg)通过诱发根部瘿瘤破坏营养吸收，可导致显著减产。更棘手的是，这种线虫既能适应淹水环境也能在旱地生存，传统形态学鉴定依赖成虫雌虫的酯酶图谱分析，而分子检测方法如PCR、LAMP等虽可靠却需要专业设备和数小时操作。随着Mg被列入欧洲EPPO A2检疫名单，开发快速、精准的现场检测技术成为当务之急。

葡萄牙国家农业与兽医研究所(INIAV)联合印度农业研究所(ICAR)的研究团队，在《Physiological and Molecular Plant Pathology》发表了基于重组酶聚合酶扩增(RPA)的创新检测方案。这项研究瞄准Mg特异的SCAR序列区域，通过设计30-35bp的长引物和含THF(四氢呋喃)位点的探针，建立了无需DNA提取、直接使用J2幼虫粗提物的等温检测体系。研究团队从菲律宾、意大利和印度获取了7个Mg地理种群，并对比了8种根结线虫(RKN)和Aphelenchoides besseyi等非目标物种，通过实时荧光qTOWER³
G平台验证了方法的特异性与灵敏度。

关键技术包括：(1)使用TwistAmp? Basic/exo试剂盒在39°C下进行RPA反应；(2)基于SCAR-MgFW/Rev引物扩增163bp片段；(3)采用三组探针筛选最优检测体系；(4)建立1:2至1:25梯度稀释的J2粗提物灵敏度模型；(5)设计1Mg:9PPN的混合种群诊断特异性测试。

3.1 RPA检测体系优化
通过对比两种引物组合，确定M-graminicola2_Fw/Rv在39°C反应20分钟时能稳定扩增目标片段。值得注意的是，该体系对商业DNA提取试剂盒和粗提物的检测效率相当，后者甚至展现出更快的扩增速度(7分90秒 vs 10分02秒)，为现场检测扫除了核酸纯化的障碍。

3.2 实时RPA检测性能
选择RPAprobe_graminicola2探针建立的25μL微量化体系，将检测成本降至2.64欧元/反应。设定50 dRn(荧光强度单位)为基线阈值时，所有Mg分离株均在8分钟(约24个循环)内出现阳性信号，而近缘种M. oryzae虽能扩增，但其信号延迟至14分钟(41.5循环)且始终低于基线，这种"时间窗差异"实现了双物种鉴别。

3.2.1 灵敏度验证
在1:5稀释度(相当于1个J2的1/5DNA量)下仍可稳定检出，诊断灵敏度测试中，即便在含9个非目标线虫的混合样本中，单个Mg也能被准确识别。这种"大海捞针"般的能力使其特别适合田间复杂样本的筛查。

3.2.2 特异性验证
除M. oryzae外，其他测试的RKN(包括M. incognita、M. javanica等)均无交叉反应。研究者特别指出，虽然Mg与M. oryzae同属"graminis group"，但探针在SCAR序列中选定的四碱基差异区域，足以产生显著的扩增动力学差异。

3.2.3 重复性验证
连续15天的跨批次实验显示，阈值循环(Ct)稳定在24.01±0.18，证实该方法适合标准化实验室应用。冻干试剂在45°C下三周稳定的特性，更凸显其在热带地区现场应用的优势。

这项研究突破了传统分子检测对精密仪器的依赖，将Mg鉴定时间从常规PCR的3小时缩短至90分钟(含样本前处理)。尤为重要的是，相比实验室自配LAMP体系12欧元/反应的成本，RPA展现出显著的经济性。研究者建议下一步开发侧流层析试纸条(LFD)或SYBR Green I可视化方案，以完全摆脱对荧光设备的依赖。作为首个能同步筛查Mg和M. oryzae的RPA方法，该技术不仅为欧盟检疫政策提供了技术支撑，其"粗提物直接检测"的设计理念更为植物病原体现场诊断树立了新范式。