棉花miR7814靶向GhCNL2调控植物对黄萎病菌抗性的分子机制

本研究揭示了棉花中新型miRNA ghr-miR7814通过靶向切割R基因GhCNL2 mRNA，调控植物对黄萎病菌（Verticillium dahliae）的抗性机制。研究人员结合GUS报告系统、VIGS（病毒诱导基因沉默）和过表达技术，证实ghr-miR7814-GhCNL2模块通过诱导ROS（活性氧）和SA（水杨酸）生物合成途径激活防御相关基因（如GhPR1、GhPR5），为棉花抗病育种提供了新靶点。

　　

棉花作为全球重要的经济作物，长期受到黄萎病的威胁。这种由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）引起的土传病害，能导致棉花叶片黄化、脱落甚至植株死亡，每年造成巨大经济损失。传统防治方法如化学药剂不仅成本高，还带来环境问题。植物自身通过NBS-LRR（核苷酸结合位点-富亮氨酸重复）类抗病(R)基因识别病原体效应因子，激活效应子触发免疫(ETI)。近年研究发现，微小RNA(miRNA)可通过转录后调控R基因表达参与免疫反应，但多数研究集中于miR482等少数miRNA家族，新型miRNA-R基因模块的机制仍待探索。

中国农业科学院植物基因组学国家重点实验室的研究团队在《Plant Science》发表论文，首次揭示了棉花中ghr-miR7814靶向CC-NBS-LRR类基因GhCNL2调控黄萎病抗性的分子通路。研究通过生物信息学预测结合GUS报告系统验证了ghr-miR7814对GhCNL2 mRNA的直接切割作用；利用病毒诱导基因沉默(VIGS)构建GhCNL2 knockdown植株，发现其抗病性显著降低，而过表达ghr-miR7814产生类似表型。关键防御基因GhPR1、GhPR3表达量变化及DAB染色显示的H₂
O₂
积累证实，该模块通过调控SA生物合成相关基因（GhICS1、GhEDS1）和ROS爆发激活免疫应答。

主要技术方法
研究采用GUS报告系统验证miRNA-mRNA互作，通过5’-RLM RACE确定切割位点；构建VIGS体系进行基因功能缺失分析；qPCR检测防御基因表达；DAB染色量化H₂
O₂
积累；使用棉花品种BD18和本氏烟进行病原接种实验。

研究结果

1. 棉花miR7814响应黄萎病菌感染
   通过small RNA测序鉴定出差异表达的ghr-miR7814，其前体基因位于棉花A11和D11染色体。

2. ghr-miR7814靶向GhCNL2的特征分析
   psRNA靶标预测锁定GhCNL2（Gh_A11G2551），其编码的CNL蛋白具有典型P-loop结构。GUS报告显示ghr-miR7814可使GhCNL2 3’UTR活性降低60%。

3. GhCNL2正向调控植物抗病性
   VIGS沉默GhCNL2导致病情指数上升41%，而SA处理可部分恢复抗性。防御基因GhPDF1.2表达量下降达75%。

4. GhCNL2促进SA和ROS合成
   沉默植株中SA合成基因GhPAD4表达量降低3.2倍，DAB染色显示H₂
   O₂
   积累增加2倍，表明ROS爆发与SA信号协同作用。

结论与意义
该研究首次阐明ghr-miR7814-GhCNL2模块通过"ROS-SA防御轴"调控棉花对黄萎病的抗性：病原侵染时，ghr-miR7814表达下调解除对GhCNL2的抑制，进而激活SA途径并诱导ROS爆发，上调PR蛋白基因表达。这一发现不仅拓展了miRNA调控植物免疫的理论框架，更为棉花抗病分子设计育种提供了精准靶标——通过编辑ghr-miR7814结合位点或调控其表达，有望培育广谱抗病新品种。研究还提示CNL类R基因在不同作物中可能存在保守的miRNA调控网络，为其他作物抗病研究提供范式。