高效提取产毒真菌镰刀菌属菌丝体高质量RNA的创新方法及其应用价值

这篇研究开发了一种基于盐酸胍缓冲液和商业化质粒DNA提取柱的快速、低成本RNA提取方法，适用于镰刀菌属（Fusarium graminearum和F. coffeatum）固体培养基和液体培养菌丝体。通过优化冻干预处理和添加RNase抑制剂，实现4–14 μg/100 mg干重的高产量RNA，RIN值达8.4，为真菌毒素合成机制研究提供高质量模板。

　　

样本制备特点
镰刀菌属菌株在形态和生理特性上存在显著差异：F. graminearum在固体培养基上形成蓬松气生菌丝，液体培养生长迅速；而F. coffeatum则产生致密菌丝和胶状结构，冻干后重量减少50–65%。这种胶状结构的高含水量提示冻干处理对后续RNA提取至关重要。

原始方案改进
研究团队对LogSpin协议进行了五项关键改良：

1. 裂解缓冲液体积增至1 mL（原500 μL）
2. 添加β-巯基乙醇（100:1）防止酚类氧化
3. 引入65°C 15分钟孵育步骤强化裂解
4. 将洗脱液2调整为含40%异丙醇和10 mM Tris-HCl（pH 6.2）
5. 在晚期培养阶段（第7天）洗脱时加入RiboCare RNase抑制剂

RNA产量与质量
比较实验显示：

• F. graminearum产量普遍高于F. coffeatum
• 冻干处理使液体培养样本RNA产量提升1.3–3.1倍
• 自建方法A₂₆₀
  /A₂₈₀
  和A₂₆₀
  /A₂₃₀
  比值优于商品化RNeasy Plant Mini Kit
• 典型电泳图谱显示清晰的18S/28S rRNA峰，F. graminearum样本RIN达8.4

qPCR验证
以延伸因子TEF1α为靶基因的定量PCR显示：

• F. graminearum cDNA检测灵敏度达10^–6
  稀释（Ct值34.2）
• 扩增效率分别为93%（F. graminearum）和86%（F. coffeatum）

技术优势与意义
该方案创新性地利用质粒DNA提取柱实现真菌RNA纯化，成本降低50%以上。冻干处理可长期保存样本而不影响RNA完整性，特别适合缺乏即时实验条件的野外研究。高RIN值表明其适用于转录组测序等精密分析，为解析镰刀菌毒素合成调控网络（如tri基因簇）提供关键技术支撑。