水稻细胞中钙调蛋白融合抗菌肽Persulcatusin的表达及其抗金黄色葡萄球菌活性研究

这篇研究通过构建钙调蛋白(CaM)融合的蜱源抗菌肽Persulcatusin(IP)基因，利用水稻悬浮细胞体系实现高效分泌表达。Western blot证实转基因愈伤组织和悬浮细胞能稳定产生融合蛋白，经TEV蛋白酶处理后释放的IP对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)具有显著抑制作用，为植物分子农业(Plant Molecular Farming)生产抗菌肽提供了新策略。

　　

水稻细胞中钙调蛋白融合抗菌肽Persulcatusin的表达研究

引言
随着抗生素耐药性问题加剧，来自硬蜱(Ixodes persulcatus)的抗菌肽Persulcatusin(IP)因其对革兰氏阳性菌(包括MRSA和万古霉素耐药金黄色葡萄球菌VRSA)的特异性膜破坏作用而备受关注。植物表达系统凭借低成本、低病原体污染风险等优势，成为重组蛋白生产的理想平台。本研究创新性地采用钙调蛋白(calmodulin, CaM)融合策略，通过水稻悬浮细胞体系实现IP的高效表达。

材料与方法
研究团队构建了含水稻α-淀粉酶3D信号肽、小鼠CaM、TEV蛋白酶识别序列和IP的融合基因，通过农杆菌(Rhizobium radiobacter)介导转化水稻品种日本晴(Oryza sativa Nipponbare)。采用特异性引物进行基因组PCR和RT-PCR验证，Western blot使用抗His标签和抗CaM抗体检测表达量，并通过径向扩散法测定对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus 209p)的抑菌活性。

结果

1. 转基因水稻细胞成功表达融合蛋白：

   • 构建的pBUH201载体含泛素启动子和优化翻译起始序列CCATG，在16个转sp-H-CaM-IP株系和7个转sp-CaM-IP株系中均检测到目标基因整合(图1)。
   • 蛋白表达量最高达34.9 μg/mg总可溶性蛋白，悬浮培养上清液中检测到分子量增大的糖基化修饰产物(图4)。

2. TEV蛋白酶有效释放活性IP：

   • 经TEV处理的蛋白提取物对S. aureus抑制圈直径显著增大(图6)，证实CaM融合可屏蔽IP的抗菌活性。
   • 悬浮培养上清液也显示微弱抑菌活性，表明分泌途径的有效性(在线资源5)。

3. 表达系统安全性验证：

   • 单独表达sp-IP的转基因水稻在形态和结实率上与野生型无差异(在线资源7)，排除了IP对植物生长的毒性。

讨论
该研究首次在植物中实现蜱源抗菌肽的高效生产。信号肽引导的分泌表达虽受培养基蛋白酶降解影响(10 DAT时蛋白量下降50%)，但通过共表达蛋白酶抑制剂(如NbPR4)可优化产量。CaM融合系统为毒性AMP表达提供了通用解决方案，其"激活式"设计可通过TEV酶切控制活性释放。与大肠杆菌表达体系相比，水稻悬浮细胞培养成本更低，且His标签简化了纯化流程——Ni树脂吸附后TEV酶切即可获得高纯度IP。

应用前景

1. 规模化生产：每克鲜重愈伤组织可产99.5 μg融合蛋白，经培养条件优化有望实现工业化。
2. 多重耐药菌治疗：IP对VRSA等超级细菌的膜攻击机制不易诱发耐药性。
3. 畜牧应用：可直接添加含IP的粗提物替代饲料抗生素，减少耐药基因传播。

技术改进方向

1. 筛选更高效的信号肽(如烟草伸展蛋白信号肽)提升分泌效率
2. 采用CRISPR敲除内源蛋白酶基因延长蛋白半衰期
3. 开发叶绿体转化体系避免核基因组沉默现象

结论
该研究证实水稻细胞能生产功能性IP融合蛋白，其模块化设计可拓展至其他抗菌肽。植物分子农业与CaM屏蔽技术的结合，为应对后抗生素时代挑战提供了可持续解决方案。