跨组学整合分析揭示肿瘤基因组与转录组联合检测的临床验证框架及其在精准医疗中的应用

本研究针对临床肿瘤学中RNA-seq与WES整合检测缺乏标准化验证框架的现状，开发了可同步评估基因表达、融合基因、肿瘤微环境特征及体细胞变异的多组学检测方案。通过对2230例临床样本的系统验证，证实该方案能显著提高基因融合检出率（较DNA单组学提升63.9%），发现98%病例存在临床可操作变异，为个性化治疗决策提供了更全面的分子图谱。

　　

在精准肿瘤学时代，DNA和RNA组学数据的整合分析正成为临床决策的关键。然而当前临床实践中，全外显子测序(WES)和RNA测序(RNA-seq)往往独立进行，缺乏标准化的联合验证方案。这种割裂导致约20%的临床相关变异被漏检，特别是基因融合和等位基因特异性表达事件。更棘手的是，福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本的核酸降解问题，使得常规检测方法的灵敏度在肿瘤纯度低于30%时急剧下降。这些技术瓶颈严重制约了多组学数据在临床环境中的应用价值。

为突破这些限制，波士顿Gene Corporation的研究团队开发了名为"Tumor Portrait"的创新检测体系。该研究通过三步验证策略（分析验证、正交测试、临床评估），系统证明了整合WES与RNA-seq的检测方案可显著提升临床相关变异的检出能力。相关成果已发表于《Communications Medicine》，为肿瘤精准诊断提供了新的技术标准。

研究团队采用多项关键技术：1）建立包含3042个体细胞单核苷酸变异(SNV)和47,466个拷贝数变异(CNV)的参考标准；2）优化外显子捕获(EC)技术处理FFPE样本；3）开发整合Strelka2和Manta的变异检测流程；4）应用Kallisto进行基因表达定量；5）采用MSIsensor2评估微卫星不稳定性(MSI)。临床验证队列包含2230例实体瘤和血液系统恶性肿瘤样本。

【Development of an integrated RNA and DNA sequencing assay】
研究团队开发了兼容FFPE样本的整合检测方案，通过添加17Mb非翻译区(UTR)探针，使RNA外显子捕获达到与poly-A富集相当的效果。关键质量参数显示：DNA检测中重复序列占比27.2±0.90%，脱靶率29.0±0.28%；RNA检测中91% reads来自编码区，满足临床分析要求。

【Analytical validation Of RNA-Seq gene expression】
通过ERCC Spike-In Mixes验证显示表达量相关性达0.96-0.97。FF与FFPE样本间基因表达相关性中位数达0.88（n=1389个变异基因）。qPCR正交验证51例临床样本的99个基因，中位相关性0.85。技术重复显示基因表达变异系数(CV)在>1 TPM时<20%。

【Gene fusion calling accuracy depends on intrinsic transcript expression level】
建立以0.1 FFPM为阈值的融合基因检测标准，在FF和FFPE样本中分别达到F1值0.95±0.02和0.91±0.01。qPCR验证115个融合的灵敏度达98.0±1.7%，特异性>99.9%。发现新型RPUSD3-NTRK2融合等69个未报道事件。

【Analytical validation of exome-wide somatic SNV and INDEL variant calling】
使用五株细胞系建立3042个变异参考集，在≥20%纯度时SNV和INDEL灵敏度分别达95.3±0.89%和85.2±3%。正交验证53例临床样本显示VAF相关性：SNV r=0.92，INDEL r=0.82。优化流程F1值显著优于Mutect2和Dragen。

【Calculating exome-wide TMB and MSI】
肿瘤突变负荷(TMB)检测在≥20%纯度时与参考材料相关性r=0.99。微卫星不稳定性(MSI)分析在临床样本中实现100%准确性。发现TMB-high样本中MSI-high占比显著升高。

【Robust single-copy CNV and LOH calling】
考虑样本倍性的CNV分类算法，在30%纯度时基因水平灵敏度>94%。Jaccard指数显示与独立实验室结果98.5%一致。30%样本存在非整倍体，强调倍性校正的重要性。

【Clinical applications】
在2230例临床样本中，平均检出173个SNV、8个INDEL、5个融合基因。98%病例携带临床可操作变异，89%存在抗体偶联药物(ADC)靶点过表达。RNA-seq额外挽救18,231个错义突变（较WES增加4.5%）。

这项研究的意义在于建立了首个跨组学整合检测的标准化验证框架。通过创新的参考标准体系和优化的生物信息学流程，解决了FFPE样本分析、低纯度肿瘤检测和多组学数据整合等临床痛点。特别值得注意的是，研究证实RNA-seq不仅能验证37.1%的DNA变异，还能通过等位基因特异性表达分析（如CDKN2A、BCL2等基因的VAF异常）提供额外的临床价值。这种多组学协同分析模式，为实现真正的肿瘤精准分型和治疗决策树立了新标杆。