CRISPRi筛选揭示大肠杆菌对庆大霉素的厌氧样呼吸适应机制：CpxR介导的膜电位去极化

这篇研究通过全基因组CRISPR干扰（CRISPRi）筛选技术，系统解析了大肠杆菌在庆大霉素（Gm）胁迫下的基因适应性变化。研究发现，庆大霉素通过抑制核糖体功能、激活毒素-抗毒素（TA）系统及改变外膜蛋白（OMP）表达，诱导类似厌氧代谢的呼吸适应，其中双组分系统CpxR通过调控呼吸链复合体（如NDH-1、Cytbo 和Cytbd -I）抑制膜电位形成，从而限制庆大霉素摄取。该研究为细菌耐药机制提供了新见解，并为靶向膜电位的抗菌策略开发奠定基础。

　　

基因组水平的基因适应性分析

研究利用高分辨率CRISPRi文库（覆盖39,591个靶点）评估大肠杆菌在庆大霉素（1 μg/mL）和厌氧条件下的基因适应性。通过计算富集比（ER），发现核糖体蛋白（如rbfA
ER降低5.0倍）、rRNA甲基转移酶（如rsmD
降低4.1倍）及毒素-抗毒素系统（如ghoS
降低9.8倍）对庆大霉素高度敏感。值得注意的是，外膜蛋白基因bhsA
的缺失导致完全耐药，其ER在庆大霉素下增加3.8倍，证实其通过降低膜通透性阻碍药物摄取。

核糖体与核糖体相关蛋白的适应性变化

庆大霉素通过结合30S核糖体亚基抑制翻译。CRISPRi筛选显示，30S和50S核糖体蛋白（如yqjD
ER降低4.7倍）及修饰酶（如腺苷化酶prmA
降低3.2倍）的适应性显著下降。16S rRNA甲基转移酶rsmD
的敏感性提示rRNA修饰可能改变庆大霉素结合位点，从而介导耐药。

毒素-抗毒素系统的双重调控

庆大霉素激活TA系统（如relBE
和mazEF
），其中抗毒素基因（如relB
ER降低7.0倍）的抑制导致毒素（如RelE mRNA内切酶）失控，加剧细胞损伤。GhoST系统中，抗毒素ghoS
的CRISPRi引发膜电位紊乱，凸显其在维持膜稳态中的关键作用。

外膜蛋白与外排泵的协同防御

外膜蛋白OmpA（ER降低3.8倍）和β-桶组装机器组分BamE（降低2.6倍）的适应性下降，表明其通过维持膜完整性抵抗庆大霉素。外排泵基因（如RND家族acrA
降低2.6倍）的抑制进一步证实主动外排是耐药的重要机制。

厌氧代谢与庆大霉素耐药的相似性

厌氧与庆大霉素处理的基因适应性高度相关（Pearson r
=0.93）。辅因子合成通路（如泛醌ubiX
ER增加30.0倍、血红素hemX
增加4.7倍）的适应性上升，提示膜电位降低是耐药的核心机制。缺失fre
（黄素还原酶）或ubiX
（泛醌合成酶）的菌株对庆大霉素耐受性增强，验证了呼吸链抑制与药物摄取的关联。

CpxR通过调控呼吸链介导膜电位崩溃

转录组与ChIP-Seq分析揭示，CpxR在庆大霉素下结合933个基因组位点，直接抑制呼吸链复合体（如nuo
、cyo
和cyd
），同时解除ArcA对厌氧代谢的抑制。流式细胞术证实cpxR
缺失株膜电位未崩溃，而野生型在庆大霉素下电位降至CCCP（羰基氰化物）处理水平。这一发现阐明CpxR通过双重调控呼吸链和膜稳态，驱动“厌氧样”耐药表型。

讨论与展望

该研究首次将CRISPRi筛选与多组学整合，揭示CpxR作为全局调控节点，通过呼吸链重编程和膜电位调控介导庆大霉素耐药。靶向CpxR或辅因子合成通路（如泛醌）可能成为逆转耐药的新策略。未来需进一步解析CpxR与ArcA的交叉调控网络，并探索其在革兰阴性菌中的保守性。