N-亚硝基乙基异丙胺(NEIPA)在大鼠肝脏中的诱变效应：基于cII转基因突变检测与双链测序技术的机制研究

本研究针对药物杂质N-亚硝基乙基异丙胺(NEIPA)的体内诱变风险，通过Big Blue转基因大鼠模型结合cII基因突变检测和双链测序(DS)技术，首次证实NEIPA在肝脏中呈现剂量依赖性诱变效应，主要引发A:T>G:C转换和A:T>T:A颠换。研究为评估N-亚硝基化合物的基因毒性提供了高灵敏度的双链测序方法学参考。

　　

在药物安全领域，N-亚硝基化合物作为潜在的基因毒杂质近年来引发广泛关注。这类物质不仅存在于腌制食品中，更令人担忧的是它们作为药物合成副产物出现在降压药等常用药品中。N-亚硝基乙基异丙胺(NEIPA)作为典型代表，虽已在体外实验中显示基因毒性，但其在哺乳动物靶器官中的真实诱变潜力仍属未知。更棘手的是，现有评估方法如细菌回复突变试验（Ames试验）存在代谢激活不充分等问题，而传统的转基因啮齿动物(TGR)检测虽能评估体内突变，却受限于外源报告基因与内源基因修复机制的差异。

针对这些技术瓶颈，来自国家药品监督管理局食品药物评价中心的研究团队在《Chemico-Biological Interactions》发表了一项突破性研究。他们创新性地将经典的cII转基因突变检测与新兴的双链测序(DS)技术联用，系统评估了NEIPA在大鼠肝脏——该物质已知的靶器官中的诱变效应。研究采用6周龄雄性Big Blue大鼠，设置0、12.5、25、50 mg/kg/day四个NEIPA剂量组，以苯并[a]芘(B[a]P)为阳性对照，通过28天灌胃暴露后采集肝脏组织进行分析。

关键技术包括：(1)基于λ噬菌体载体的cII转基因突变检测，通过温度筛选突变体；(2)双链测序(DS)技术，利用独特分子标识符(UMI)追踪DNA片段，检测灵敏度达10^-8
；(3)基准剂量(BMD₅₀
)建模量化遗传损伤阈值。实验动物来自英国Gentronix公司，所有操作遵循OECD测试指南488号。

【动物体重变化】数据显示NEIPA处理组体重增长显著低于对照组，50 mg/kg组最终体重降低13.2%，提示该剂量已达明显毒性水平。

【NEIPA诱变性】cII检测发现突变频率呈剂量依赖性激增，高剂量组(868.4×10^-6
)较空白对照(20.8×10^-6
)提升42倍；DS技术检测到更高灵敏度，突变频率从6×10^-8
升至708.5×10^-8
，增幅达119倍。值得注意的是，DS测得的BMD₅₀
值显著低于cII检测结果，证明其检测敏感性优势。

【突变特征谱】DS分析揭示NEIPA特异性诱导A:T>G:C转换(占42.1%)和A:T>T:A颠换(31.6%)，这与B[a]P诱导的G:C>T:A颠换(56.3%)及空白组的G:C>A:T转换(68.2%)形成鲜明对比，提示NEIPA可能通过形成O⁶
-烷基鸟嘌呤加合物诱发突变。

研究结论表明：(1)NEIPA是大鼠肝脏强效诱变剂，其诱变效应与致癌性存在机制关联；(2)DS技术较传统cII检测灵敏度提高1-2个数量级，特别适合低剂量暴露评估；(3)突变特征谱可作为N-亚硝基化合物的生物标志物。该研究不仅为药物杂质风险评估提供了新方法学范式，更通过体内数据验证了ICH M7指南将NEIPA归为1类杂质的科学性。通讯作者Tao Chen指出，这种整合新旧技术的策略未来可扩展应用于其他N-亚硝基药物相关杂质(NDSRIs)的评估，为制定更精确的每日允许摄入量(ADI)标准提供依据。