嗜水气单胞菌flgK/flgL/flgE三基因缺失减毒株的构建及其作为鲫鱼活疫苗的潜力研究

针对水产养殖中嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)引发的重大经济损失问题，西南大学团队通过敲除鞭毛基因flgK/flgL/flgE构建三基因缺失减毒株AH-ΔKLE。研究发现该菌株毒力降低35.91倍，能显著激活鲫鱼非特异性免疫（ACP/AKP等酶活性提升）和特异性免疫（IgM抗体水平升高），相对保护率达78.33%，为开发安全高效的活疫苗(LAV)提供了新策略。

　　

水产养殖业正面临嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的严峻挑战。这种革兰氏阴性菌能引发运动性气单胞菌败血症(MAS)，造成高达90%的死亡率，每年导致数十亿元经济损失。尽管抗生素曾是主要防控手段，但耐药性和环境残留问题日益凸显。目前中国仅有一种灭活疫苗获批，其保护率不足50%。如何开发更安全高效的疫苗？鞭毛系统成为突破口——它不仅是细菌的运动器官，更是毒力调控的关键开关。

西南大学研究人员选择鞭毛钩-丝连接蛋白基因flgK、flgL和钩蛋白基因flgE作为靶点，通过同源重组技术构建三基因缺失减毒株AH-ΔKLE。实验采用平均体重15±0.5g的鲫鱼(Carassius auratus)为模型，通过腹腔注射评估免疫效果。关键技术包括：基因敲除验证（PCR片段大小分析）、毒力测试（半致死剂量LD₅₀
计算）、免疫指标检测（ELISA测IgM、qPCR分析细胞因子）及组织病理学观察。

研究结果

1. 减毒株构建与表型分析
   AH-ΔKLE成功实现鞭毛结构缺失，运动能力下降85%。毒力测试显示其LD₅₀
   较野生株(AH-WT)提高35.91倍，生物被膜形成能力降低62%，溶血活性减弱70%。qPCR证实毒力相关基因（如aerA、ahyB）表达下调。

2. 非特异性免疫激活
   免疫144小时后，鲫鱼血清中酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)等8种免疫指标显著提升。其中溶菌酶(LZM)活性增加3.2倍，表明先天免疫系统被强烈激活。

3. 特异性免疫应答
   在鳃、脾和头肾组织中，促炎因子TNF-α和抗炎因子IL-10在6-48小时内同步上调，呈现Th1/Th2混合反应。第4周时，特异性抗体IgM滴度达到峰值，显著高于灭活疫苗组（P<0.01）。

4. 保护效力验证
   攻毒实验显示，AH-ΔKLE组的相对存活率(RPS)达78.33%，较灭活疫苗组(45.33%)提高73%。组织切片证实疫苗未引起鳃、肠道等器官的病理损伤。

结论与意义
该研究首次证实flgK/flgL/flgE三基因联合缺失能协同增效，通过破坏鞭毛完整性实现毒力衰减与免疫原性的平衡。AH-ΔKLE不仅能激活鲫鱼黏膜免疫（鳃组织IL-8高表达），还可诱导系统免疫记忆（脾脏MHCI⁺
细胞增多）。相比传统灭活疫苗，其保护率提升近1倍，且符合绿色养殖理念。论文发表于《Fish & Shellfish Immunology》，为水产疫苗研发提供了"减毒不减效"的新范式，对解决抗生素滥用问题具有重要实践价值。