RNA阴离子中鸟苷碱基与磷酸二酯基团裂解促进相互作用的本质偏好：基于碱基修饰与质谱技术的研究

本研究通过碱基修饰(c1 G/c3 G/c7 G、m2 G/m2 2 G)和鸟苷-肌苷(I)替换实验，结合质谱技术揭示了RNA阴离子(M-nH)n- 中鸟苷(G)通过双齿相互作用特异性促进5'侧磷酸二酯键断裂的分子机制。该发现不仅阐明了气相RNA自发裂解的化学本质，还为理解自剪切核酶(Ribozyme)的催化进化策略提供了新视角。

　　

在生命活动中，RNA不仅是遗传信息的载体，更是具有催化功能的核酶(Ribozyme)的主要执行者。其中，磷酸二酯键的断裂与连接是核酶最常见的催化反应，但关于其分子机制仍存在关键盲区。长期以来，研究者们注意到一个有趣现象：无论是碱性溶液中的RNA水解，还是气相中RNA阴离子(M-nH)^n-
的振动活化解离，鸟苷(G)的5'侧磷酸二酯键总是优先断裂。这种选择性裂解暗示着鸟苷碱基与相邻磷酸基团存在特殊相互作用，但其结构基础和化学本质始终未能阐明。

因斯布鲁克大学的研究团队通过系统性的碱基工程和质谱技术，首次揭示了这一现象背后的分子机制。他们设计合成了一系列位点特异性修饰的RNA（包括1-脱氮鸟苷c¹
G、3-脱氮鸟苷c³
G、7-脱氮鸟苷c⁷
G，以及N2-甲基化m²
G和N2,N2-二甲基化m²
₂
G修饰），结合鸟苷-肌苷(I)替换策略，通过低能碰撞活化解离(CAD)质谱分析发现：鸟苷通过其N3原子和环外氨基与5'侧磷酸二酯基团的两个非桥接氧形成双齿氢键网络，这种独特的相互作用既稳定了磷酸基团的质子化状态（实现β催化），又精确排列2'-OH进行亲核攻击（实现α催化）。该成果发表于《Nucleic Acids Research》。

关键技术方法包括：1）固相合成18-27nt位点修饰RNA（含脱氮/甲基化鸟苷类似物）；2）碱性条件下(pH 9.0-13.0)RNA水解动力学实验；3）电喷雾电离(ESI)产生多电荷阴离子(M-nH)^n-
；4）傅里叶变换离子回旋共振(FT-ICR)质谱进行碰撞活化解离(CAD)分析；5）通过片段电荷分布验证反应中间体。

主要研究结果

1. 鸟苷的裂解促进效应：CAD谱图中c/y片段主要源自G的5'侧断裂，在(M-7H)^7-
   离子中占比达60%（随机预期35%），且随电荷密度增加呈现钟形曲线（峰值在0.4电荷/核苷酸）。

2. N3的关键作用：3-脱氮修饰(c³
   G)使G5位点裂解效率降低10倍，而1-脱氮(c¹
   G)无影响，证实N3是必需质子受体。

3. 环外氨基的协同贡献：肌苷(I)替换或N2-甲基化(m²
   G)使裂解效率降低3倍，N2,N2-二甲基化(m²
   ₂
   G)更导致20倍抑制，说明环外氨基作为质子供体参与形成第二个氢键。

4. 溶液验证：pH 13.0水解实验显示G13/G16位点优先断裂，而pH 9.0无此偏好，证实该效应是RNA固有属性。

结论与意义
该研究首次在原子水平揭示了鸟苷通过N3-磷酸OH和环外氨基-非桥接氧的双氢键网络，实现磷酸二酯键断裂的"三位一体"催化机制（α/β/δ催化）。这一发现不仅解释了气相RNA离子的解离规律，更从分子进化角度为理解核酶活性中心的构建提供了新思路——现代核酶复杂的催化架构可能起源于此类简单的碱基-磷酸相互作用模块。此外，研究建立的碱基修饰策略为RNA结构-功能研究提供了新工具，而裂解位点偏好性的认识对质谱法RNA测序中的电荷调控和甲基化分析具有重要指导价值。