基于HiBiT技术的活细胞mRNA翻译高通量监测系统开发及其在mRNA疗法优化中的应用

本研究针对mRNA疗法开发中缺乏蛋白特异性翻译监测工具的难题，剑桥大学团队创新性地将HiBiT（高亮度生物发光标签）技术应用于mRNA翻译动态研究。通过建立体外（兔网织红细胞裂解系统）和细胞（HEK293 LgBiT稳定株）双重检测平台，首次实现不同5'UTR结构、核苷酸修饰、poly(A)尾长等因素对特定蛋白编码mRNA翻译效率的实时量化。研究发现优化策略需根据目标蛋白特性定制，为mRNA药物设计提供了新型高通量筛选工具。

　　

在生物医药领域，mRNA技术正从新冠疫苗向肿瘤疫苗、蛋白替代疗法等更广阔领域拓展。然而当前mRNA优化研究严重依赖GFP（绿色荧光蛋白）等报告基因，这些高度工程化的蛋白具有异常稳定的翻译特性，无法反映治疗性蛋白的真实表达规律。更棘手的是，现有翻译监测技术如多核糖体分析、Ribo-seq（核糖体测序）等存在操作复杂、无法实时监测等局限，严重制约了mRNA药物的开发效率。

剑桥大学药理学系Camilla Ascanelli*、Elsa Lawrence等研究者突破性改造HiBiT技术——一种仅含11个氨基酸的纳米荧光素酶片段，将其作为蛋白标签与目标蛋白共表达。当与细胞中稳定表达的LgBiT大亚基结合时，可产生实时生物发光信号。团队通过兔网织红细胞裂解物（RRL）体外翻译系统和HEK293-LgBiT细胞系，建立了从分钟级到18小时的全时程监测体系，并验证了其在人胚胎干细胞来源心肌细胞（hESC-CMs）等原代细胞中的适用性。

关键技术包括：1）构建含不同非编码元件的HiBiT标记mRNA文库；2）RRL体外翻译结合化学发光检测；3）LgBiT稳定表达细胞的活体发光监测；4）qRT-PCR验证mRNA稳定性与免疫原性；5）蛋白质印迹与生物发光双验证系统。

CAP和5'UTR的影响
研究发现CleanCap与ARCA（抗反向帽类似物）在体外翻译效率无差异，但CleanCap显著降低TLR3等免疫基因激活。通过设计MFE（最小自由能）达-46.89 kcal/mol的5'UTR发夹结构，证实细胞中严苛的二级结构会使翻译效率降低58.3%，而RRL系统无法反映这种差异，凸显细胞模型的重要性。

编码序列优化
比较eGFP-HiBiT与6种治疗相关蛋白发现：1）eGFP翻译效率超MYL3-HiBiT（肌球蛋白轻链）4.6倍；2）转录因子中Jun-HiBiT表达最高，Myc-HiBiT最低；3）YAP8SA-HiBiT（转录共激活因子突变体）呈现独特持续上升曲线。通过Myc T58A磷酸化位点突变和密码子适应指数（CAI）优化组合，使蛋白输出增加84%，证明"一刀切"的优化策略不适用于所有蛋白。

核苷酸修饰
pseudouridine（pU）修饰使Myc-HiBiT翻译提升61%，但对eGFP无显著影响。N1-methylpseudouridine（N1mU）虽降低免疫应答，但可能引起核糖体移码，提示修饰选择需权衡翻译效率与精确性。

poly(A)尾调控
40个腺苷酸（40A）即可保证有效翻译，80A与120A无显著差异。但3A尾因无法结合PABPC（多聚腺苷酸结合蛋白）导致mRNA快速降解，蛋白表达降低90%。

这项研究开创性地将HiBiT技术拓展至mRNA翻译领域，其核心价值在于：1）首次实现治疗蛋白特异性翻译动态追踪，打破依赖报告基因的局限；2）揭示优化策略需"量体裁衣"，如Myc需要CAI优化而非MFE；3）建立的高通量平台可加速mRNA药物元件筛选。该成果发表于《Nucleic Acids Research》，为个性化mRNA疗法设计提供了不可替代的工具箱，尤其对半衰期短的转录因子类药物开发具有里程碑意义。