OfWRKY33通过结合关键芳樟醇合成酶基因OfTPS7启动子调控桂花芳樟醇合成的分子机制

本研究针对桂花(Osmanthus fragrans)花香成分中关键芳樟醇(linalool)合成的分子调控机制展开。研究人员通过基因组和转录组测序鉴定出核心芳樟醇合成酶基因OfTPS7，并发现转录因子OfWRKY33能直接结合OfTPS7启动子的W-box元件，协同调控MEP途径基因表达，首次揭示了WRKY家族转录因子调控花香合成的分子机制。该研究为芳香植物代谢工程提供了重要靶点。

　　

桂花作为中国传统名花，其独特的芳香主要来源于花朵中丰富的挥发性萜类化合物，其中芳樟醇(linalool)及其氧化物是最关键的香气活性成分。虽然前人已鉴定出部分萜类合成酶(TPS)基因，但不同栽培品种间芳樟醇含量差异的分子机制仍不清楚，特别是对核心合成基因的筛选及其转录调控网络的认识亟待深入。

华中农业大学的研究团队通过系统性研究，在《Horticulture Research》发表论文，首次在桂花中鉴定出关键芳樟醇合成酶基因OfTPS7，并揭示转录因子OfWRKY33通过直接结合OfTPS7启动子W-box元件来调控芳樟醇合成的分子机制。研究采用多组学联用策略，通过对20个栽培品种的代谢组分析，筛选出芳樟醇含量最高的"波叶银桂"(BBYG)进行基因组和转录组测序。

关键技术方法包括：1) 基于PacBio和Hi-C技术完成染色体级别基因组组装；2) 通过酵母单杂交(Y1H)筛选与OfTPS7启动子互作的转录因子；3) 应用加权基因共表达网络分析(WGCNA)挖掘关键调控模块；4) 采用双荧光素酶(LUC)和电泳迁移率实验(EMSA)验证蛋白-DNA相互作用；5) 通过烟草瞬时转化和体外酶活实验验证基因功能。

Linalool是桂花花朵的关键特征性香气化合物
研究团队首先对20个栽培品种盛花期花朵进行顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用(HS-SPME-GC-MS)分析，发现萜类占总挥发物的70%以上，其中芳樟醇及其氧化物占比最高且气味活性值(OAV)突出。品种间比较显示"波叶银桂"的芳樟醇含量最高，且其含量在花朵发育过程中呈现先升高后降低的趋势，盛花期达到峰值。

萜类合成酶基因家族的鉴定
通过高质量基因组组装(contig N50=18.83 Mb)和转录组分析，新鉴定出25个OfTPSs基因。系统发育分析将其分为TPS-a、TPS-b和TPS-g三个亚家族。时空表达谱显示，OfTPS7的表达模式与芳樟醇积累高度一致。

OfTPS6和OfTPS7在体内外均能提高芳樟醇产量
功能验证表明，只有OfTPS6和OfTPS7能在烟草叶片和桂花花朵中特异性产生芳樟醇。体外酶活实验证实两者能催化香叶基二磷酸(GPP)生成芳樟醇及少量副产物。亚细胞定位显示OfTPS7定位于质体，而OfTPS6位于细胞质。瞬时过表达OfTPS7使芳樟醇含量提高7.7倍，而基因沉默则显著降低其含量。

OfTPS7在多个栽培品种芳樟醇合成中起关键作用
种群分析发现OfTPS7在所有20个品种中均表达，且其表达水平与芳樟醇含量呈最强正相关(r=0.82)，而其他TPS基因要么表达受限，要么相关性较弱。这表明OfTPS7是桂花芳樟醇合成的核心基因。

Y1H结合WGCNA筛选出潜在转录因子OfWRKY33
通过酵母单杂交筛选和共表达网络分析，鉴定出WRKY家族转录因子OfWRKY33。该基因在花中高表达且模式与芳樟醇积累一致，其表达水平与芳樟醇含量(r=0.96)和OfTPS7表达(r=0.90)均呈极显著正相关。

OfWRKY33通过激活OfTPS7转录促进芳樟醇合成
实验证实OfWRKY33定位于细胞核，能直接结合OfTPS7启动子的W-box元件。双荧光素酶报告系统显示OfWRKY33可使OfTPS7启动子活性提高3倍以上。EMSA进一步验证了这种特异性结合。转基因花朵中，OfWRKY33过表达不仅上调OfTPS7，还协同激活MEP途径基因OfDXS1等的表达，使芳樟醇含量显著增加。

这项研究首次在桂花中系统鉴定了TPS基因家族，明确了OfTPS7的核心地位，并揭示了OfWRKY33通过直接调控OfTPS7表达来协调芳樟醇生物合成的分子机制。该发现不仅完善了花香合成调控网络的理论基础，也为通过分子育种定向改良桂花香气品质提供了重要靶点。研究采用的"基因组-代谢组-转录调控"多组学联用策略，为其他芳香植物的次生代谢研究提供了范式。特别值得注意的是，OfWRKY33的保守性使其可能成为跨物种调控萜类合成的通用工具，在香料作物改良和微生物合成生物学领域具有广阔应用前景。