单分子磁镊技术揭示8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)损伤对端粒DNA沃森-克里克与霍格steen碱基配对稳定性的动态影响

本研究通过单分子磁镊技术，首次系统量化了氧化损伤标志物8-oxoG在端粒DNA不同位点对双链结构（沃森-克里克配对）和G-四链体（霍格steen配对）稳定性的差异化影响。研究发现5'端8-oxoG可使DNA解链速率提升130倍，显著降低G-四链体折叠自由能（ΔG从5.9 kB T降至2.3 kB T），为理解氧化应激导致的端粒功能障碍及基因组不稳定性提供了分子动力学依据。

　　

在生命活动中，DNA持续遭受活性氧攻击，其中鸟嘌呤因还原电位最低最易被氧化形成8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)。作为最常见的氧化损伤标志物，每个细胞每天可产生超过2800个8-oxoG病变。这种损伤在富含鸟嘌呤的端粒区域尤为显著，可能加速端粒缩短——这一过程与衰老和细胞 senescence（衰老）密切相关。更棘手的是，8-oxoG既能维持沃森-克里克配对（与胞嘧啶形成8-oxoG-C），又会干扰G-四链体(G-quadruplex, G4)的霍格steen氢键网络，但不同位点损伤对核酸结构稳定性的定量影响始终存在争议。

华中科技大学同济医学院的研究团队在《Nucleic Acids Research》发表创新成果，通过高精度单分子磁镊技术，首次绘制了8-oxoG在端粒DNA不同位置的动态损伤图谱。研究设计包含25bp端粒重复序列（(GGGTTA)₄
）的发夹结构，在5'端、中部及3'端特定位点引入单个8-oxoG修饰，同时构建野生型对照。通过力谱分析和圆二色谱(CD)联用，团队发现：位于发夹中部的8-oxoG-C对维持双链稳定性影响微弱（ΔΔG~1 k_{B），而5'端损伤则引发显著的末端解链效应，使10.1 pN力下的解链速率暴增130倍。更令人惊讶的是，当8-oxoG位于G4结构的5'-GGG端时，其折叠自由能从5.9 kB
T骤降至2.3 kB
T，CD熔解温度降低15°C，揭示了氧化损伤对非经典核酸结构的特殊破坏机制。}

关键技术方法包括：1）构建不同位点8-oxoG修饰的端粒DNA发夹及G4序列；2）单分子磁镊力谱分析（力加载速率2 pN/s）定量解链力与步长；3）恒力模式下测量折叠/解折叠动力学参数；4）圆二色谱监测热稳定性变化；5）贝尔-阿伦尼乌斯模型拟合能量景观。

端粒DNA发夹中单个8-oxoG取代可形成具有异质机械稳定性的不同物种
通过力-梯度实验发现，5'端8-oxoG修饰的发夹（Tel-8-oxoG3-hairpin-20T）呈现双峰解链力分布：70%完全折叠态（10.4±0.6 pN）与30%部分折叠态（8.3±0.4 pN），后者步长减少17nt，提示前3个碱基未配对。野生型则呈现单一解链峰（10.7±0.4 pN），CD熔解实验显示两者T_m
仅相差0.6°C，证实中部损伤对整体稳定性影响有限。

5'端8-oxoG取代引起显著末端解链效应并阻碍完整发夹形成
将发夹环从20T缩短至4T后，5'端损伤（Tel-8-oxoG3-hairpin-4T）完全转变为部分折叠态，解链力降低1.3 pN，步长减少7nt。而中部修饰（Tel-8-oxoG15-hairpin-4T）仍保持野生型特性（解链力11.4 vs 11.6 pN），计算显示单个8-oxoG-C对杂交能的贡献仅比G-C对弱1 k_B
T。对比实验发现，G-T错配的中部修饰使解链力降低1.7 pN，说明8-oxoG的破坏性远低于错配。

恒力测量揭示8-oxoG对折叠/解折叠速率的位点特异性调控
临界力（F_c
）分析显示，5'端损伤使平衡点从11.4 pN降至10.1 pN，折叠自由能减少11 k_B
T（40→29 k_B
T）。动力学参数显示，10.1 pN时解链速率k_u
提升130倍，证实末端损伤显著促进机械力诱导的解链。

5'端8-oxoG显著降低端粒G4的解链力与霍格steen氢键稳定性
力谱分析发现，Tel-8-oxoG3-G4解链力峰值从16 pN降至12 pN，零力解链速率k_u0
增加2.2倍。折叠概率分析显示其饱和值从89%降至74%，折叠速率降低6.7倍。CD证实其熔解温度降低15°C，ΔG减少3.6 kcal/mol，说明氧化损伤通过破坏Hoogsteen氢键网络优先攻击G4结构。

这项研究首次建立了8-oxoG位点效应与核酸结构稳定性的定量关系：1）在经典双链中，末端损伤通过促进"末端解链"显著降低机械稳定性，而中部损伤影响微弱；2）在G4结构中，5'端氧化直接破坏四链体核心稳定性。这些发现为解释复制叉处8-oxoG诱导的突变热点现象提供了动力学基础，同时揭示端粒G4可能是氧化应激的"分子传感器"。该成果不仅完善了核酸能量参数数据库，对设计抗氧化纳米器件、开发靶向氧化损伤的抗癌策略也具有重要指导意义。