正黄病毒基因组RNA保守长程相互作用对其稳定折叠的关键作用

本研究针对正黄病毒基因组RNA(vRNA)中保守的5'和3'末端互补序列如何调控病毒生命周期这一关键问题，通过单分子荧光共振能量转移(smFRET)技术揭示了vRNA存在延伸和环化两种异常稳定的构象状态。研究发现宿主起始因子复合物eIF4F能以ATP依赖方式动态重塑vRNA构象，阐明了保守互补序列通过多部分长程相互作用维持vRNA构象双稳态的分子机制，为理解正黄病毒复制调控提供了新视角。

　　

在病毒学领域，正黄病毒属(Orthoflavivirus)包括登革热病毒(DENV)、西尼罗河病毒(WNV)和寨卡病毒(ZIKV)等重要人类病原体，其单链RNA基因组具有独特的5'-7-甲基鸟苷(m⁷
G)帽子结构但缺乏poly(A)尾巴。这些病毒的基因组RNA(vRNA)在5'和3'非翻译区(UTR)含有保守的互补序列，被认为通过长程RNA-RNA相互作用使基因组环化，从而协调病毒复制和翻译。然而，这些相互作用的具体性质、构象群体及其转换机制尚不清楚，阻碍了对病毒生命周期调控机制的深入理解。

斯坦福大学医学院的研究团队在《Nucleic Acids Research》发表的研究中，创新性地采用单分子荧光共振能量转移(smFRET)技术，通过测量5'-3'末端距离来研究vRNA的全局构象。研究发现正黄病毒vRNA呈现构象异质性，末端距离较近的构象相比缺乏特定长程相互作用的mRNA具有异常的动力学稳定性。vRNA至少分区于两种稳定状态之间，末端区域发生>50 ?的剧烈重排。这种双稳态依赖于长程相互作用，并可被eIF4F等宿主因子动态调控。

关键技术方法包括：生物信息学分析1418株登革热病毒序列的保守性；构建含5'-3'UTR的微型基因组和全长DENV2 vRNA；通过高碘酸盐氧化和酰肼染料进行5'和3'端荧光标记；利用全内反射荧光显微镜(TIRF)和零模波导(ZMW)芯片进行smFRET成像；通过迁移率分析和RNase H消化验证RNA构象；纯化人源翻译起始因子(eIF4A、eIF4B、eIF4E、eIF4G)研究其对vRNA构象的调控作用。

vRNA构象具有异质性
研究发现正黄病毒5'-3'UTR构建体在缺乏蛋白条件下可折叠成延伸和环化两种状态。smFRET显示DENV2 5'-3'UTR存在E_FRET
=0.00±0.03的延伸状态和E_FRET
=0.87±0.05的环化状态，后者占优势。与动态的β-珠蛋白mRNA相比，vRNA构象转换速率极慢(≥2.4分钟)，表现出异常的动力学稳定性。镁离子(Mg²⁺
)对稳定环化构象至关重要，其浓度变化可调控构象分布。

CS碱基配对对末端近距离至关重要
通过突变环化序列(CS)破坏5'-3'互补性，使FRET-on状态比例从36%降至8-11%。用DNA寡核苷酸阻断CS相互作用或引入补偿性突变分别抑制或部分恢复环化构象。添加6个额外碱基对可提高环化构象比例至51%，证实CS相互作用对维持末端近距离的关键作用。

UAR碱基配对维持构象稳定性
虽然UAR突变对构象分布影响较小，但完全阻断5'-3'UAR相互作用使构象转换速率加快200倍以上。UAR突变体显示E_FRET
=0.29±0.09的中间状态和快速构象波动(k_obs
≈0.16-1.04 s^-1
)，表明UAR相互作用对环化构象的异常稳定性不可或缺。

DENV血清型呈现不同构象特征
在四种DENV血清型中，DENV1 5'-3'UTR表现出独特的低FRET状态(E_FRET
=0.2-0.4)和高动态性，而DENV2-4主要呈现高FRET状态。SLB和3'-SL的稳定性差异不能完全解释这种构象差异，提示其他远端序列可能参与调控。

全长DENV2 vRNA的环化特征
全长(10.7 kb)和截短vRNA的smFRET分析表明，16%全长vRNA保持稳定高FRET状态，而缺乏3'UTR的截短体仅4%显示FRET信号且动态变化，证实保守互补序列对维持全长vRNA构象的重要性。

翻译起始因子重塑vRNA构象
eIF4F复合物(eIF4A/eIF4B/eIF4E/eIF4G)在ATP存在下可在8秒内将环化vRNA转变为延伸构象。非水解ATP类似物ADPNP或单独eIF4A均不能诱导这种重塑，表明需要eIF4F的协同作用和ATP水解活性。

该研究首次在单分子水平证实全长正黄病毒vRNA通过保守的多部分长程相互作用形成异常稳定的构象双稳态。这种特性可能帮助病毒在宿主细胞的不同环境中维持功能构象。研究发现eIF4F能特异性靶向环化构象并促进其解离，为理解病毒如何利用宿主因子调控基因组构象转换提供了分子基础。这些发现不仅深化了对正黄病毒复制调控机制的认识，也为开发靶向vRNA构象转换的抗病毒策略提供了新思路。特别值得注意的是，不同血清型DENV表现出的构象差异可能与其致病性和宿主适应性相关，这为后续研究病毒进化与RNA结构关系开辟了新方向。