磷酸盐调控网络（Pho regulon）的分子机制与磷酸盐依赖性大肠杆菌基因重构：一种新型生物防控策略的开发

本研究针对生物防控中抗生素抗性标记的局限性，通过CRISPR-Cas12a基因编辑技术重构了磷酸盐（Pt）依赖性大肠杆菌菌株，揭示了PhoBR双组分调控系统对Pho regulon基因过度表达的调控作用。该研究为无抗性标记的生物防控策略提供了技术支撑和理论依据，对合成生物学安全应用具有重要意义。

　　

在合成生物学快速发展的今天，如何防止基因工程微生物在自然环境中的意外扩散成为亟待解决的科学难题。传统依赖抗生素抗性标记的生物防控方法存在环境风险和临床应用限制，而磷酸盐（Pt）作为一种自然界中罕见的磷源，为生物防控提供了新思路。日本研究团队通过基因工程手段构建了Pt依赖性大肠杆菌菌株，但发现Pho regulon（磷酸盐调控网络）基因的异常激活影响了菌株性能，且多重抗性标记阻碍了进一步遗传改造。

为解决上述问题，研究人员采用CRISPR-Cas12a基因组编辑技术，成功去除了抗性标记并构建了更易操作的Pt依赖性菌株。通过RNA-seq和qRT-PCR分析发现，缺失phoU（Pho regulon负调控因子）和pstSCAB（高亲和力磷酸盐转运系统）导致Pho regulon基因显著上调。进一步研究发现，删除phoBR（双组分调控基因）可缓解这种过度表达并部分恢复菌株生长能力。

关键技术包括：1）CRISPR-Cas12a介导的基因组编辑；2）RNA-seq转录组分析；3）qRT-PCR验证基因表达；4）使用MOPS（3-(N-吗啡啉)丙磺酸）最小培养基进行表型分析。

【Bacteria and media】
研究使用LB和MOPS培养基培养菌株，通过比较MOPS-Pi（含磷酸盐）、MOPS-Pt（含磷酸盐）和MOPS-0（无磷）条件下的生长差异，证实了菌株的Pt依赖性。

【Analysis of gene expression changes】
RNA-seq显示Pt依赖性菌株RN1008中有54个基因上调（包括Pho regulon成员）和37个基因下调。phoU和pstSCAB的缺失导致Pho信号通路持续激活，而phoBR的删除使这种激活部分恢复正常。

研究结论表明，PhoBR系统是调控Pt依赖性菌株代谢平衡的关键靶点。该工作不仅为生物防控策略提供了更安全的无抗性标记技术方案，还深化了对Pho regulon调控机制的理解。日本科学技术振兴机构（JST）等资助的这项研究发表于《Journal of Bioscience and Bioengineering》，为合成生物学的安全应用树立了新标准。