基于TAT-PEG-SS-PEI纳米载体共递送HHLA2/EGFR siRNA协同抑制结直肠癌的机制研究

本研究针对结直肠癌(CRC)治疗中EGFR靶向治疗耐药及免疫逃逸难题，构建了TAT肽修饰的氧化还原响应型纳米颗粒(T-NPs/siRNA)，实现HHLA2与EGFR siRNA的协同递送。通过体外实验证实，该纳米系统具有105.12±0.61 nm的均一粒径、GSH响应释放特性及卓越的血清稳定性，通过小窝蛋白/网格蛋白双重内吞途径高效入胞并实现溶酶体逃逸。双siRNA共载显著抑制RKO细胞增殖迁移（P<0.01），协同下调MEK/ERK信号通路关键蛋白磷酸化，为克服EGFR治疗耐药提供了新策略。

　　

在全球癌症负担排名第三的结直肠癌领域，两个关键难题长期困扰临床：EGFR靶向治疗耐药和肿瘤免疫逃逸。尽管西妥昔单抗等抗EGFR药物已广泛应用，但肿瘤微环境(TME)中B7家族免疫检查点分子（如PD-L1、HHLA2）的异常激活导致治疗失败。更棘手的是，研究发现EGFR突变会通过MEK/ERK通路上调HHLA2表达，形成"靶向治疗-免疫抑制"的恶性循环。这种双重机制使得传统单靶点治疗举步维艰，亟需开发能同时阻断致癌信号和免疫逃逸的创新疗法。

青岛某研究团队在《Journal of Drug Delivery Science and Technology》发表的研究给出了突破性解决方案。研究人员创造性设计出TAT修饰的氧化还原敏感型纳米载体(PEG-SS-PEI)，该载体巧妙利用肿瘤组织高谷胱甘肽(GSH)特性实现精准释药。通过将免疫调节靶点HHLA2 siRNA与传统靶点EGFR siRNA共装载，构建了具有"双靶协同"功能的纳米药物系统。

研究采用三大关键技术：1) 透射电镜与动态光散射表征纳米颗粒理化性质；2) 荧光标记追踪细胞内吞途径及溶酶体逃逸过程；3) Transwell和伤口愈合实验评估肿瘤转移抑制效果。所有实验均以人结直肠癌细胞RKO为模型，并设置空白纳米颗粒对照组。

【Characterization and encapsulation efficiency of T-NPs/siRNA】
纳米颗粒经10倍稀释后仍保持105.12±0.61 nm的稳定粒径，zeta电位+15.2 mV，电镜显示规则球形结构。凝胶阻滞实验证实其可完全包裹siRNA并抵抗RNase降解，在50%血清中48 h内保持结构完整。

【In vitro release and cellular uptake】
在10 mM GSH环境中，siRNA 24 h累积释放率达82.3%，显著高于生理GSH浓度组(P<0.01)。共聚焦显微镜显示，TAT修饰使细胞摄取效率提升3.2倍，主要通过小窝蛋白和网格蛋白双重内吞途径，2 h内即实现溶酶体逃逸。

【Antitumor effect evaluation】
MTT实验显示双siRNA组对RKO细胞的抑制率(78.6±3.2%)显著高于单siRNA组(P<0.01)。划痕实验证实迁移抑制率达71.4%，Transwell显示侵袭细胞数减少83%。Western blot揭示MEK1/2、ERK1/2及其磷酸化蛋白表达量下降60%-75%。

这项研究的意义在于：首次将免疫检查点HHLA2与经典靶点EGFR纳入同一纳米治疗系统，通过"基因沉默-免疫调节"双重机制破解治疗耐药。TAT-PEG-SS-PEI载体设计的氧化还原响应特性实现了肿瘤特异性释药，其溶酶体逃逸能力解决了核酸药物递送的关键瓶颈。该策略为开发下一代CRC联合疗法提供了全新思路，相关载体技术可拓展应用于其他难治性肿瘤的RNAi治疗。