毛细管电泳一步法快速测定酶动力学及抑制常数的创新策略

本研究针对传统酶动力学分析方法步骤繁琐、耗时长的问题，开发了一种基于毛细管电泳(CE)的一步法策略。通过优化进样程序、在线反应与分离检测流程，实现了碱性磷酸酶(ALP)和α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)动力学参数的高效测定，并成功筛选出15种抑制剂。该方法结合重力介导毛细管电泳(AGM-CE)技术，解决了弱信号和分离难题，为药物发现提供了新工具。

　　

酶是生命活动的核心催化剂，在农业、工业、医学等领域具有广泛应用。然而，传统酶动力学分析方法面临两大挑战：一是需要多次实验测定不同底物浓度下的反应速率，耗时且易引入误差；二是生物样本中酶含量低（如丙氨酸氨基转移酶ALT），且受高丰度蛋白（如白蛋白）干扰。毛细管电泳(CE)技术虽能整合反应与检测过程，但现有电泳介导微分析(EMMA)方法仍需多步操作。

针对这些瓶颈，中国研究人员在《Microchemical Journal》发表论文，提出革命性的一步法CE策略。该方法通过独特的长酶区带-窄底物区带进样设计，使底物在迁移过程中与酶区带动态接触并反应，结合重力介导毛细管电泳(AGM-CE)延长反应时间，仅需单次运行即可获取完整动力学数据。关键技术包括：1）优化进样时间、酶/底物浓度等参数；2）利用区带零体积混合特性构建动态反应系统；3）通过产物峰形拟合Michaelis-Menten方程计算K_m
和V_max
；4）在运行缓冲液中加入抑制剂测定表观常数。

酶反应模型
通过理论推导证明，当底物浓度[S]略高于K_m
时，产物峰的非高斯分布部分包含完整动力学信息。实验验证该模型适用于ALP催化对硝基苯磷酸盐(p-NPP)水解体系。

碱性磷酸酶分析
采用AGM-CE模式成功解决ALP产物对硝基苯酚(p-NP)弱紫外吸收问题。测定K_m
为0.18±0.01 mM，与传统方法结果一致，相对标准偏差(RSD)仅1.81%。

α-葡萄糖苷酶研究
该酶与糖尿病治疗相关，实验测得K_m
为1.02±0.03 mM，RSD为2.82%。发现13种化合物对其有明显抑制作用，其中两种还能抑制ALP。

抑制剂筛选
从15种化合物中快速鉴定出特异性抑制剂，包括ALP抑制剂2种和α-葡萄糖苷酶抑制剂13种，为抗糖尿病药物开发提供新候选。

这项研究突破性地将复杂酶反应动力学分析简化为单次CE实验，相比传统方法效率提升80%以上。其创新性体现在：1）首创"动态区带反应"理论模型；2）整合AGM-CE增强检测灵敏度；3）建立普适性抑制剂筛选平台。该方法不仅适用于微量酶分析（检测限达nM级），还可推广至其他生物分子相互作用研究，为生命科学研究和药物开发提供强大工具。研究获得国家自然科学基金(21605112)支持，由Pingyi Zheng、Xiao Zhang等共同完成，通讯作者为Youxin Li。