骨肉瘤免疫细胞浸润关键生物标志物HTRA1的筛选鉴定及其临床意义

本研究针对骨肉瘤(OS)免疫浸润不足导致的预后不良问题，通过CIBERSORT算法分析88例OS样本的免疫细胞浸润特征，结合GO/KEGG/PPI网络筛选出CCL5、CXCL9、CXCL13和HTRA1等枢纽基因。研究发现HTRA1低表达与OS不良预后相关，其通过调控CD8+ /CD4+ T细胞浸润影响肿瘤微环境，实验证实HTRA1可抑制MG63细胞恶性表型。该研究为OS免疫治疗提供了新靶点，HTRA1可作为预后评估的潜在生物标志物。

　　

骨肉瘤作为儿童和青少年最常见的恶性骨肿瘤，其治疗困境始终困扰着临床医生——尽管手术联合化疗提高了生存率，但五年生存率仍停滞在60%-70%。更棘手的是，肿瘤微环境中免疫细胞的"冷肿瘤"特征（即免疫细胞浸润不足）导致免疫治疗响应率不足15%。这种免疫荒漠现象的形成机制及其关键调控因子，成为突破治疗瓶颈的重要科学问题。

为揭示这一机制，研究人员开展了系统性研究。通过对88例骨肉瘤样本进行转录组测序和CIBERSORT算法（一种基于基因表达反卷积计算免疫细胞组成的生物信息学方法）分析，首次绘制了骨肉瘤免疫浸润图谱。令人振奋的是，研究发现CD8⁺
T细胞、活化记忆CD4⁺
T细胞和浆细胞的浸润水平与患者预后呈显著正相关。这提示激活特异性T细胞亚群可能改善"冷肿瘤"微环境。

研究团队进一步运用多组学交叉分析策略：通过基因本体(GO)分析揭示差异基因主要富集于免疫应答调控通路；京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析显示趋化因子信号通路异常活跃；蛋白质相互作用(PPI)网络则筛选出CCL5、CXCL9、CXCL13和HTRA1四个枢纽基因。其中丝氨酸蛋白酶HTRA1的发现尤为关键——免疫荧光证实其在50例骨肉瘤组织中表达显著降低，且与免疫评分呈正相关。

在机制探索中，研究采用LASSO回归（最小绝对收缩和选择算子算法）证明HTRA1高表达组患者总生存期延长40%。体外实验显示，过表达HTRA1的MG63细胞增殖速率下降60%，侵袭能力减弱55%。这些发现共同勾勒出HTRA1通过重塑免疫微环境抑制肿瘤进展的作用蓝图。

主要技术方法
研究整合生物信息学与实验验证：1) CIBERSORT算法分析88例OS样本的免疫浸润特征；2) GO/KEGG/PPI网络筛选枢纽基因；3) 50例OS样本的双重免疫荧光验证；4) 免疫组化检测HTRA1表达；5) LASSO回归分析预后价值；6) MG63细胞功能实验。

Result

1. 免疫浸润特征：CD8⁺
   T细胞与活化记忆CD4⁺
   T细胞构成预后保护性亚群，其浸润水平每增加1%，患者死亡风险降低18%。
2. 枢纽基因鉴定：CCL5、CXCL9与CXCL13作为趋化因子调控T细胞招募，HTRA1表达与CD8⁺
   T细胞浸润量呈0.78强相关(r=0.78, p<0.001)。
3. HTRA1功能验证：免疫组化显示HTRA1阳性组5年生存率达72.3%，显著高于阴性组的41.5%(p=0.008)。

Conclusion
该研究首次确立HTRA1作为骨肉瘤免疫治疗的新靶标：1) 其通过调控T细胞浸润重塑"冷肿瘤"微环境；2) 表达水平可预测患者预后；3) 体外实验证实其直接抑制肿瘤恶性行为。这些发现为开发基于HTRA1的免疫调节策略提供了理论依据，相关成果发表于《Molecular and Cellular Probes》。研究不仅解决了骨肉瘤免疫治疗响应标志物缺失的临床难题，更为实体瘤免疫微环境调控提供了普适性研究范式。