揭示肝片形吸虫早期感染阶段的蛋白质组动态：从肠道穿透到肝实质迁移的分子适应机制

本研究通过建立小鼠体内感染模型，结合SWATH-MS蛋白质组学技术，首次系统解析了肝片形吸虫(Fasciola hepatica)在感染脊椎动物宿主早期(24小时腹腔期和8天肝脏期)的蛋白质表达谱。研究发现274个和463个差异表达蛋白分别与寄生虫穿透肠壁和肝实质迁移相关，揭示了其向厌氧代谢转变、生长相关信号通路激活及半胱氨酸蛋白酶(Cathepsin/Legumain)富集等关键适应机制，为开发靶向早期感染阶段的疫苗候选分子提供了重要依据。

　　

肝片形吸虫(Fasciola hepatica)是全球范围内重要的人畜共患寄生虫，每年造成畜牧业约30亿美元经济损失，并威胁全球1700万人口健康。这种寄生虫的感染始于宿主摄入囊蚴(metacercariae)，新脱囊幼虫(FhNEJ)在3小时内穿透肠壁进入腹腔，4-10天后迁移至肝脏实质。这段"不归路"般的早期迁移过程是决定感染成败的关键阶段，但此前对寄生虫穿透肠壁后8天内分子适应机制的研究仍存在空白。传统体外培养模型难以模拟宿主微环境对寄生虫发育的调控作用，而现有蛋白质组数据多集中在21天后的肝脏期或体外培养阶段。

为解决这一科学问题，来自科尔多瓦大学的研究团队建立了优化的C57BL/6小鼠感染模型，通过时序性收集24小时腹腔期和8天肝脏期寄生虫，结合高精度SWATH-MS(Sequential Window Acquisition of All Theoretical Mass Spectra)定量蛋白质组技术，首次绘制了肝片形吸虫早期感染阶段的动态蛋白质图谱。研究成果发表在《Molecular 》期刊上，揭示了寄生虫从自由生活状态向专性吸血寄生虫转变的关键分子事件。

研究采用三大关键技术方法：1)建立标准化小鼠感染模型，通过时序性寄生虫收集(3小时体外FhNEJ、24小时腹腔期和8天肝脏期)获取生物样本；2)分区提取寄生虫体蛋白(somatic)和皮层蛋白(tegumental)进行SWATH-MS分析；3)运用生物信息学方法(包括PCA、KEGG通路和GO富集分析)系统解析差异表达蛋白(DEP)的功能特征。实验设计包含三个生物学重复，所有质谱数据已提交至PRIDE数据库。

【Set-up of an in vivo mouse infection model】
研究人员优化建立了高回收率的小鼠感染模型，24小时腹腔期和8天肝脏期寄生虫回收率分别达9.38%和21.19%。通过测量发现寄生虫体长从体外培养阶段的135.9±24.18 μm增长至8天期的665.7±128.20 μm，证实模型能有效支持寄生虫发育。肝脏组织病理显示典型的虫体迁移轨迹，为后续蛋白质组分析提供了可靠样本。

【Protein identification and quantification】
SWATH-MS共鉴定1,180个肝片形吸虫蛋白(占总量71.78%)，主成分分析(PCA)显示体外培养与体内获取的寄生虫蛋白质谱存在显著分离。体蛋白与皮层蛋白呈现明显分区特征，其中皮层蛋白富集代谢相关通路和半胱氨酸蛋白酶。

【Differential expression profile】
比较分析发现：24小时期与体外FhNEJ存在274个DEP，其中37个体蛋白和233个皮层蛋白下调，而皮层中18个蛋白(包括硫氧还蛋白、过氧化物酶和Cathepsin B家族成员)显著上调；8天期与24小时期比较显示64个DEP，核糖体蛋白和组蛋白修饰酶等翻译相关蛋白显著增加；8天期与体外FhNEJ比较则发现532个DEP，反映寄生虫发育的深刻分子重构。

【Metabolic pathways】
KEGG分析揭示：24小时期寄生虫主要依赖糖酵解和TCA循环等有氧代谢途径，而8天期出现向厌氧代谢转变趋势，表现为苹果酸酶(K00025)表达增加和丙酮酸激酶(K00873)表达下降。同时，PI3K-Akt、Hippo等调控细胞生长的信号通路在肝脏期显著激活。

【Cysteine peptidases】
半胱氨酸蛋白酶呈现发育阶段特异性表达：Cathepsin B1/B2/B3在24小时期高表达，B6/B13-14在8天期富集；Cathepsin L3在早期活跃，而L1/L2在肝脏期占主导。蛋白酶抑制剂中，Stefin 1(FhStf1)在早期高表达，多结构域胱抑素(FhCys1)则在肝脏期占优。免疫印迹验证了Cathepsin B3(FhCB3)在24小时期的特异性表达。

这项研究首次系统揭示了肝片形吸虫早期感染阶段的分子适应策略：1)代谢重编程表现为从有氧向兼性厌氧代谢的渐进式转变；2)生长相关信号通路在肝脏期集中激活；3)半胱氨酸蛋白酶家族呈现时空特异性表达模式。这些发现填补了从肠壁穿透到肝脏定植关键阶段的分子空白，为开发阻断早期感染的干预策略提供了理论依据。特别值得注意的是，8天肝脏期寄生虫已表现出与21天期相似的蛋白质组特征，提示宿主微环境对寄生虫发育的诱导作用可能比预期更早。研究建立的标准化感染模型和蛋白质组数据集，将为后续疫苗靶点筛选和体外培养体系优化提供重要参考。