P4PP：一种基于鸟枪法蛋白质组学的通用病毒鉴定数据分析流程及其在疫情防范中的应用

研究人员开发了P4PP（Proteome for Pandemic Preparedness）流程及配套数据库（P4PP v01），通过LC-MS/MS技术结合特异性肽段识别策略，实现了对32个病毒科1896种病毒物种的高通量检测。该研究验证了其在160份病毒感染样本中91.25%的准确识别率，并能对流感A（H1N1/H3N2/H5N1）和SARS-CoV-2（B.1.1.7/B.1.351等）进行亚型分型，为应对突发性病毒疫情提供了新型诊断工具。

　　

在COVID-19和猴痘疫情暴发后，全球意识到现有生物监测技术对未知病毒的检测能力存在严重不足。传统方法如PCR和免疫检测依赖预先设计的特异性引物或抗体，难以应对突发性病原体。而病毒培养虽具有广谱性，但依赖细胞病变效应（CPE）观察，耗时长且灵敏度有限。这种技术缺口促使科学家探索更高效的病原体筛查方案。

荷兰的研究团队开发了名为P4PP（Proteome for Pandemic Preparedness）的创新性解决方案。这项发表在《Molecular》期刊的研究，通过整合鸟枪法蛋白质组学（shotgun proteomics）与定制化数据库，建立了可检测1896种病毒物种的分析流程。该系统基于病毒特异性肽段的精准识别，突破了传统方法对已知病原体信息的依赖，为应对未来可能出现的病毒威胁提供了技术储备。

研究采用多中心验证策略，关键技术包括：1）构建包含32个病毒科蛋白组的P4PP v01数据库；2）使用SP3（Single-Pot Solid-Phase-enhanced Sample Preparation）和FASP（Filter-Aided Sample Preparation）等方法处理样本；3）通过Orbitrap系列质谱仪（Q-Exactive、Exploris 480等）进行LC-MS/MS分析；4）应用PEAKS X软件进行肽段匹配（FDR≤0.1%）；5）开发基于网络的可视化分析平台（proteome2pathogen.com）。验证样本涵盖9个独立数据集共174份样本，包括Vero、A549等细胞系培养的21种病毒物种。

研究结果部分显示：

1. 检测效能验证：在160份阳性样本中，146份（91.25%）实现种水平准确鉴定，4份达到科水平识别。10份假阴性样本均来自感染初期低病毒载量样本，后续时间点检测均转为阳性。
2. 亚型分型能力：成功区分流感A亚型（H1N1/H3N2/H5N1）和SARS-CoV-2变异株（Alpha/Beta/Gamma/Delta），其中SARS-CoV-2 Beta株（B.1.351）与B.1.621因71个共有肽段需联合报告。
3. 动态监测特征：在HSV-1感染模型中，病毒肽段数量从感染后4小时开始显著增加，与病毒复制周期一致；而VZV因高比例非感染性颗粒（40,000:1），在0小时即检测到阳性信号。
4. 交叉反应分析：Togaviridae科的Rio Negro病毒因与委内瑞拉马脑炎病毒存在15个共有肽段，导致种水平鉴定困难，凸显近缘物种的鉴别挑战。
5. 特异性验证：14份阴性对照中仅1份出现HSV-1假阳性（3个肽段），推测为实验交叉污染所致。

讨论部分强调，P4PP的创新性体现在三个方面：首先，其"科-种"二级分析策略通过家族特异性肽段（≥3个）和种特异性肽段（≥3个）的双重验证，确保结果可靠性；其次，数据库设计包含所有已知人类致病病毒科，并预留新发病毒纳入空间；最后，标准化分析流程适配不同实验室的质谱平台，在6个机构9种仪器上验证了方法稳定性。

该研究的临床意义在于：1）为诊断实验室提供不依赖预判的病毒筛查方案，尤其适合病因不明的感染病例；2）通过培养后检测兼顾病毒活性验证，弥补宏基因组测序（MGS）的局限性；3）亚型分型功能可快速识别具有流行病学意义的变异株。作者也指出，当前版本对Togaviridae等高度保守病毒科的鉴别仍需优化，且数据库需要定期更新以涵盖新发毒株。

这项技术突破将病毒诊断的"主动防御"能力提升到新高度。正如研究者所述，在Mpox疫情中，如果临床实验室常规运行此类广谱检测，可能会更早发现异常信号。随着自动化程度的提高和成本下降，P4PP有望成为生物安全预警系统的重要组成部分，为应对下一次未知疫情提供关键技术支持。