优化蛋白质组学策略鉴定胶质瘤中小开放阅读框编码肽的创新研究

本研究针对小开放阅读框编码肽(SEPs)因长度短、丰度低导致质谱(MS)检测困难的挑战，开发了基于甲酸铵介导的C8固相富集(AmF-C8-SPE)新策略。通过结合分级洗脱和LC-MS/MS技术，在18对胶质瘤样本中鉴定出549个新型SEPs，其中113个呈现肿瘤-正常组织差异表达。研究通过合成肽验证和融合蛋白表达实验确认SEPs存在性，并发现与胶质瘤进展相关的SEPs簇。该成果为发现新型生物标志物和靶点提供了重要资源，发表于《Molecular 》期刊。

　　

在生命科学领域，基因组中大量未被注释的小开放阅读框(sORFs)长期以来被忽视，但近年研究发现其编码的小开放阅读框编码肽(SEPs)在生理和病理过程中扮演重要角色。然而，SEPs的鉴定面临两大技术瓶颈：一是传统基因预测算法因长度限制难以准确识别sORFs；二是质谱(MS)检测受限于SEPs的短肽链特性(通常<100个氨基酸)和低丰度，目前仅有不到0.3%的预测SEPs能被实验验证。特别是在胶质瘤这种最具侵袭性的脑肿瘤中，SEPs的调控机制和临床价值亟待探索。

四川大学华西医院的研究团队针对这一科学难题，开发了创新的甲酸铵介导C8固相富集(AmF-C8-SPE)技术，结合分级洗脱策略显著提高了SEPs的鉴定效率。该研究在18对胶质瘤患者的肿瘤/正常组织样本中系统鉴定了549个新型SEPs，其中113个呈现差异表达特征，相关成果发表在《Molecular 》期刊上。

关键技术方法包括：(1)优化AmF-C8-SPE富集流程，采用7级乙腈梯度洗脱；(2)基于Tricine凝胶电泳评估富集效率；(3)Orbitrap Exploris^TM
480质谱仪进行LC-MS/MS分析；(4)整合OpenProt和SmProt数据库进行SEPs鉴定；(5)通过合成肽MS匹配和EGFP融合表达系统验证SEPs；(6)采用Mfuzz聚类和ROC曲线分析SEPs与胶质瘤分期的关联；(7)DeepLoc预测和共聚焦显微镜验证SEPs亚细胞定位。

【优化Enrichment和MS-Based Workflow】
研究团队首先对传统C8 SPE方法进行革新：用MS兼容的甲酸铵(AmF)替代三乙基甲酸铵(TEAF)缓冲液，避免甲醇/氯仿沉淀步骤造成的样品损失；建立7级乙腈梯度洗脱方案，使SEPs鉴定数量较传统方法提高3倍(210 vs 73)，且序列覆盖度>80%的SEPs比例显著增加。Tricine凝胶显示新方法可富集3.4-19 kDa的更广分子量范围。

【SEP Profiling in Glioma】
应用优化方案分析临床样本发现：549个高置信度SEPs中71%使用经典AUG起始密码子，19%使用近同源起始密码子。转录本溯源显示49%源自假基因，27%来自蛋白编码基因。值得注意的是，92.2%的SEPs获得>10%序列覆盖度，稳定性分析显示其不稳定指数显著低于SwissProt数据库标准蛋白。

【实验验证】
研究通过"双保险"策略验证结果：(1)合成10个SEPs标准品进行MS谱图匹配，8个成功验证；(2)构建pEGFPmut-N1融合表达系统，Western blot不仅检测到预期SEPs-EGFP条带，还发现多个由替代起始密码子产生的异构体，证实sORFs存在复杂翻译调控。

【胶质瘤进展相关SEPs】
Mfuzz聚类揭示8个SEPs表达模式簇，其中64个SEPs随肿瘤分级升高而下调(如IP_789158)，49个呈上升趋势(如IP_182847)。ROC曲线分析显示这些SEPs的AUC值具有显著临床相关性，Western blot进一步验证其可翻译性。

【亚细胞定位特征】
DeepLoc预测显示35% SEPs定位于线粒体，25%分泌至胞外。实验证实两个含核定位信号(NLS)的SEPs(IP_613981和SPROHSA206836)主要分布在细胞核，暗示其可能参与转录调控。

这项研究通过技术创新突破了SEPs检测的技术瓶颈，首次在胶质瘤中建立全面SEPs图谱。其科学价值体现在三方面：首先，AmF-C8-SPE方法为微蛋白研究提供强大工具；其次，发现的差异表达SEPs为胶质瘤分子分型提供新维度；最后，核定位SEPs的发现暗示非编码RNA可能通过编码微蛋白直接参与表观遗传调控。未来研究可深入探索特定SEPs(如PI3K/AKT通路相关分子)的功能机制，或开发针对SEPs的靶向治疗策略。该成果也为其他肿瘤的SEPs研究提供了方法论范本。