从发现到递送：一种用于监测中国仓鼠卵巢生物制造的快速靶向蛋白质组学工作流程

为解决CHO细胞生物制造过程中缺乏快速、精准的监测手段问题，研究人员开发了"发现到靶向"蛋白质组学工作流程。通过ZenoTOF 7600和Cyclic IMS QToF平台鉴定3358个蛋白质，筛选出8个关键生物标志物，并建立15分钟MRM检测方法。该研究为生物反应器质量控制提供了分子水平的解决方案，显著提升生物制药生产效率。

　　

在生物制药领域，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是生产重组治疗性蛋白的"主力军"，全球生物制剂市场规模在2024年已达到4580亿美元，其中单克隆抗体(mAbs)占据最大份额。然而，传统CHO细胞系开发依赖耗时耗力的层级筛选方法，难以揭示影响生物反应器性能的深层细胞机制。随着生物制药产品类型日益多样化，从传统单抗到新型治疗模式，行业亟需更灵活、高效的细胞培养监测技术。

针对这一挑战，FUJIFILM Diosynth Biotechnologies等机构的研究人员开展了一项创新性研究，开发了从发现到靶向的蛋白质组学工作流程。该研究通过整合先进的质谱技术和生物信息学分析，为CHO细胞生物制造过程提供了全新的监测方案。相关成果发表在《Molecular》杂志上。

研究人员主要采用了几项关键技术：1)使用ZenoTOF 7600和Cyclic IMS QToF质谱仪进行非靶向蛋白质组学分析；2)基于S-trap方法的样品前处理技术；3)多反应监测(MRM)靶向蛋白质定量方法；4)利用Spectronaut软件进行数据分析。研究样本来自三组平行运行的2L fed-batch生物反应器，连续14天每日取样。

【Fed Batch Bioreactor】
研究首先建立了14天的fed-batch培养系统，使用专有的CHO DG44-IgG表达细胞系。通过每日监测发现，细胞培养呈现典型的生长、稳定期和死亡期三个阶段，这一过程与蛋白质表达谱的变化高度相关。

【Proteomics Sample Preparation】
采用优化的S-trap样品前处理方法，实现了高效、稳定的蛋白质提取和消化流程，为后续质谱分析奠定基础。

【LC-MS】
通过两种高性能质谱平台(ZenoTOF 7600和Cyclic IMS QToF)的对比分析，共鉴定出3358个蛋白质，其中ZenoTOF 7600表现出更优的检测性能，定量蛋白数量达到2958个，是Cyclic IMS QToF的2.4倍。

【MRM Assay Development】
从大量差异表达蛋白中筛选出8个关键生物标志物，包括与细胞增殖相关的MCM2和PCNA，与能量代谢相关的LDHA和MCAT，以及与氧化应激相关的GSTM7和LAMP1等。针对这些标志物建立了15分钟的MRM检测方法。

【RESULTS and DISCUSSION】
主成分分析(PCA)将生物反应器运行过程清晰地分为三个阶段，分别对应细胞生长(0-3天)、稳定期(4-9天)和死亡期(10-14天)。研究发现LDHA在"乳酸转换"关键节点(第4天)出现显著变化，而分子伴侣蛋白CLUS则在整个培养过程中持续上升，提示其可能作为单抗折叠的潜在标志物。

建立的MRM方法虽然显示出比非靶向分析更高的变异性，但能准确反映不同培养阶段关键蛋白的相对丰度变化。例如，增殖标志物MCM2和PCNA在培养后期几乎检测不到，而应激相关蛋白TGM2和MCAT则显著增加，占比达到总信号的10%。

【CONCLUSIONS】
该研究成功将发现蛋白质组学转化为实用的靶向检测方案，仅需4小时样品制备和15分钟仪器分析时间即可获得可靠结果。相比传统方法如细胞计数或ELISA，这种基于质谱的策略能提供更深入的生物学见解，例如可以区分细胞活力下降是由于氧化应激还是其他原因所致。

这项工作的创新性体现在：1)首次建立了覆盖CHO细胞培养全过程的蛋白质动态图谱；2)开发了快速、特异的MRM检测panel；3)为生物制造过程监控提供了新的分子水平质量指标。未来，该方法可拓展应用于灌注生物反应器监测、高产细胞株筛选等领域，推动生物制药生产向更精准、高效的方向发展。