SpyTag/SpyCatcher介导的SpyRing环化提升固定化酶催化失活后的操作稳定性与复性效率

针对多亚基固定化酶易失活且复性效率低的难题，研究人员通过SpyTag/SpyCatcher介导的SpyRing环化技术改造L-苯丝氨酸醛缩酶（LPA），发现环化变体Gx-SRLPA在操作稳定性（87.9%活性恢复）和复性效率（1 M GuHCl/pH 9条件下）显著优于天然酶Gx-LPA（52.9%），为工业酶再生提供了新策略。

　　

酶作为自然界高效催化剂，在工业生产中具有不可替代的作用，但游离酶易失活、难回收的特性限制了其应用。固定化技术虽能提升稳定性，但多亚基酶在苛刻催化环境（如有机溶剂、高温）下仍易失活，且传统复性方法效率低下。更棘手的是，工业中失活固定化酶常被直接废弃，造成资源浪费。如何实现高效复性成为酶工程领域的关键挑战。

北京科技大学研究团队以L-苯丝氨酸醛缩酶（LPA）为模型，创新性融合SpyTag/SpyCatcher标签构建环化变体SRLPA，并将其与天然LPA共价固定于甘氨酸-琼脂糖载体（Gx），系统比较了Gx-LPA与Gx-SRLPA的性能差异。研究发现，SpyRing环化结构不仅能增强酶的操作稳定性，还能通过部分去折叠-复性策略（低浓度盐酸胍/弱碱性条件）显著提升复性效率，相关成果发表于《Process Biochemistry》。

关键技术方法
研究采用SpyTag/SpyCatcher介导的蛋白质环化技术构建SRLPA，通过His标签亲和层析纯化酶蛋白，并利用甘氨酸-琼脂糖载体（Gx）进行共价固定。采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析酶构象变化，通过连续催化反应评估操作稳定性，建立基于盐酸胍（GuHCl）浓度和pH优化的复性体系。

研究结果

操作稳定性对比
在模拟工业催化体系中，Gx-SRLPA展现出更持久的活性维持能力。连续反应数据显示，环化结构有效抑制了酶亚基解离，其半衰期较Gx-LPA延长2.3倍，证实SpyRing能增强多亚基酶的结构刚性。

复性策略优化
针对催化失活酶，团队开发了"部分去折叠-复性"方案：1 M GuHCl处理使酶适度解折叠，弱碱性条件（pH 9）促进正确重折叠。Gx-SRLPA复性效率达87.9%，远超Gx-LPA（52.9%）。添加二硫苏糖醇（DTT）可进一步修复氧化损伤的巯基，FTIR证实环化结构能保留更多α-螺旋构象。

结论与意义
该研究首次将SpyRing环化技术与固定化酶复性相结合，证明环化结构通过稳定亚基相互作用和二级结构，显著提升多亚基酶的工业适用性。提出的分级复性策略为固定化酶再生提供了普适性方案，其87.9%的活性恢复率创同类研究新高。未来可拓展至其他多亚基工业酶改造，对实现绿色生物制造具有重要价值。