基于计算环路重构设计的高效PET水解酶及其在塑料循环经济中的应用

本研究针对PET塑料酶解工业化应用中酶活性不足的瓶颈问题，通过计算重构β6-β7环结构设计出热稳定性(Tm 92°C)与活性显著提升的PET水解酶变体Bhr-NMT。该团队创新性地将环重构突变(H218N/F222M)移植至LCC-ICCG和Kubu-PM12等工程酶，在165 g kg-1 高底物浓度下实现93-94%的PET转化率，较基准酶提升8-11个百分点，为工业级PET废料回收提供了高效生物催化方案。

　　

塑料污染治理正面临严峻挑战，全球每年生产的8200万吨聚乙烯对苯二甲酸酯(PET)塑料中仅有9%被回收利用。传统化学降解方法存在能耗高、产物纯度低等问题，而酶法解聚虽条件温和却受限于催化效率不足。尤其在高底物浓度(>15% w/v)条件下，现有PET水解酶需要大量使用才能达到90%转化率，严重制约工业化应用的经济可行性。

中国石油大学的研究团队在《Communications Biology》发表研究，通过计算重构PET水解酶的β6-β7环结构，开发出兼具高热稳定性和催化活性的工程酶。研究以热稳定性达95.6°C的Bhr-PETase为模板，结合过渡态(TS)复合物能量计算和分子动力学模拟，设计出活性提升87%的变体Bhr-NMT(H218N/F222M/F243T)。该工作创新性地将环重构策略拓展至LCC-ICCG和Kubu-PM12等工程酶，在工业相关条件下实现突破性降解效率。

研究采用的关键技术包括：1)基于PRODA计算酶设计平台的过渡态模型构建；2)Modeler蛋白建模工具的β6-β7环重构；3)高精度分子动力学模拟(10×1 ns)评估催化指标；4)纳米差示扫描荧光法(nanoDSF)测定熔解温度；5)5L生物反应器规模化验证。使用市售可乐瓶制备的消费后PET(Pc-PET)粉末(7.33%结晶度)作为降解底物。

【聚合物结构特征指导的PET水解酶计算重设计】
通过构建包含三个PET单体的模型底物，量化分析非晶态PET关键扭转角特征：I型键(CA-CD-O-C)最优角180°，III型键(O-C-C-O)呈现±60°构象优势。基于四步丝氨酸水解酶机制，聚焦酰化过渡态(TS1)的能量优化，对活性中心10?范围内的11个位点进行氨基酸类型变异设计。

【基于环重构的计算酶设计】
发现野生型中W190残基与PET存在严重范德华排斥(2.7?)。通过Modeler生成50种环构象，筛选出Loop10使W190与PET距离增至4.2?。双突变体M10(F222M/F243T)通过增强M222与L172/H191的疏水堆积提升热稳定性，三突变体M20(H218N/F222M/F243T)则使活性较野生型提升1.87倍。

【工业条件下的高效变体验证】
在165 g kg^-1
底物浓度和0.5 mg_enzyme
g_PET
^-1
酶载量下，Bhr-NMT在70℃反应24小时实现93%总转化率。酶载量降至0.3 mg_enzyme
g_PET
^-1
时仍保持81%转化率，显著优于LCC-ICCG(71%)。温度适应性测试显示，75℃时Bhr-NMT活性持续增强，表明其活性位点在高温下保持稳定。

【环重构突变的普适性移植】
在序列相似性42.9%的Kubu-PM12中引入H218N/F222M突变，使Kubu-PM12-NM在相同条件下实现94%转化率(较模板提升11%)。晶体结构(PDB:9KL9)显示突变使β6-β7环向α5螺旋靠近，扩大结合口袋。N218与P214形成新氢键替代野生型H218-H191相互作用，增强环区柔性。

该研究通过计算引导的环重构策略，突破性地解决了PET水解酶活性与稳定性难以兼得的难题。变体在工业相关条件下展现的卓越性能(0.3 mg_enzyme
g_PET
^-1
载量达91%转化率)，使酶成本降低40%成为可能。特别值得注意的是，环重构突变显著提升重组蛋白产量，LCC-ICCG-NM在5L发酵罐中达1.49 g L^-1
，为规模化生产奠定基础。研究揭示的"构象选择-底物匹配"设计原则，为其他合成高聚物的生物降解酶开发提供了普适性方法论。