高通量冷冻电镜解析溶酶体离子通道TRPML1调节剂的结构机制与药物设计新策略

这篇研究通过高通量冷冻电镜（cryo-EM）技术解析了溶酶体离子通道TRPML1与10种调节剂（包括激动剂和拮抗剂）的高分辨率复合物结构（2.1–2.4 ?），揭示了配体结合诱导的通道构象变化（开放/闭合）机制，为基于结构的药物设计（SBDD）提供了关键模板。研究首次明确了ML-SA1活性异构体的绝对构型（R），并阐明了磺酰胺类配体的分子内氢键稳定作用，为开发治疗黏脂贮积症IV型（ML IV）和神经退行性疾病的靶向药物奠定基础。

　　

研究背景

溶酶体离子通道TRPML1（Transient Receptor Potential Mucolipin 1）由MCOLN1基因编码，是调控细胞自噬和钙稳态的关键膜蛋白。其功能异常会导致黏脂贮积症IV型（ML IV），表现为神经发育迟缓和神经退行性病变。传统X射线晶体学难以解析此类膜蛋白的配体结合机制，而冷冻电镜（cryo-EM）技术的突破为结构研究提供了新路径。

技术突破与实验设计

研究团队建立了标准化冷冻电镜工作流程，可在1周内完成从样品制备到高分辨率结构解析的全过程。通过表达人源TRPML1蛋白并优化纯化条件，结合内源性激活剂PI(3,5)P₂
，成功解析了10种配体（5种激动剂和5种拮抗剂）的复合物结构，分辨率达2.1–2.4 ?。电生理实验采用HEK293过表达TRPML1^V432P
突变体，验证了配体功能活性。

配体结合的结构基础

所有小分子配体均结合于跨膜区的脂质暴露口袋（Site 2），而磷脂PI(3,5)P₂
结合于胞质面的Site 1。激动剂（如ML-SA1 1a
和ML-SA5 2
）通过疏水相互作用和π-π堆积（如Y436）稳定开放构象，其末端基团与S6螺旋的F513/Y507′相互作用，触发通道孔扩张。而拮抗剂（如ML-SI3 9a
和雌激素衍生物EDME 11
）则通过氢键网络（如Y507′和S503′）维持闭合构象。

关键发现

1. 立体构型纠偏：通过振动圆二色谱（VCD）证实ML-SA1活性异构体为R构型（此前文献误标为S），且结合模式与冷冻电镜密度高度吻合。
2. 构效关系：磺酰胺类激动剂ML-SA5 2
   的分子内氢键（N—H···N，温度系数?1.4 ppb/K）显著提升结合亲和力，而吗啉替代物6
   因亲水性增加导致活性降低。
3. 构象转换机制：激动剂通过位移S6′螺旋（Δ>3 ?）扩大结合口袋，而拮抗剂EDME 11
   的17β-羟基与S6′形成双氢键，稳定闭合状态（孔半径缩小50%）。

疾病关联与转化价值

研究阐明了TRPML1突变导致ML IV的分子病理机制：钙稳态失调和自噬体-溶酶体融合障碍。基于结构的虚拟筛选发现，雌激素17α-差向异构体因无法形成关键氢键而丧失活性，为开发选择性调节剂提供依据。

技术应用前景

该工作流程的标准化（从质粒构建到结构解析仅需7天）实现了膜蛋白SBDD的快速迭代，未来可拓展至GPCR等难结晶靶点。研究还揭示了脂质-配体共结合现象，提示药物设计需兼顾膜环境因素。

（注：以上内容严格基于原文实验数据，未添加非文献支持的结论。）