肠道共生菌Bacteroides thetaiotaomicron形态异质性的代谢分化机制：低输入RNA-seq揭示的细胞大小特异性基因表达程序

这篇研究通过低输入RNA-seq技术揭示了肠道共生菌Bacteroides thetaiotaomicron（B. thetaiotaomicron）形态异质性背后的代谢分化机制。作者发现细胞大小差异与特定基因表达程序相关，验证了脂质代谢（如spt、fabD、lpxD）和转运蛋白（RND泵）等关键基因对细胞形态的因果贡献，为理解微生物表型异质性提供了方法论蓝本。

　　

形态异质性的表型特征
Bacteroides thetaiotaomicron在实验室培养和哺乳动物肠道环境中均表现出显著的形态多样性。透射电镜和共聚焦显微镜显示，其细胞长度可从1μm延伸至20μm，远超出细胞周期解释的范围。非拟杆菌门物种（如Salmonella enterica和Clostridioides difficile）则呈现更均一的形态。值得注意的是，在贫营养的MMG培养基中细胞普遍较小，而宿主肠道内（尤其是黏液层）的细菌形态与MMG培养条件相似，暗示环境适应性调控。

细胞周期与形态可塑性的关系
通过β-内酰胺抗生素cefoxitin抑制细胞分裂的实验表明，形态异质性仅部分依赖细胞周期进程。同步化处理后3代内即恢复原始形态分布，且小细胞亚群表现出更长的生长滞后期，提示存在代谢状态依赖的形态重置机制。流式分选（FACS）结合再生实验证实，不同大小亚群可相互转化，表明该过程具有可逆性。

低输入转录组技术的突破
研究团队优化了多重退火dC尾定量单细胞RNA-seq（MATQ-seq）方案，攻克了厌氧菌RNA稳定（50% RNA_later
处理）、裂解（超声替代溶菌酶）和核糖体RNA去除（DASH技术将rRNA占比从80%降至<20%）三大技术瓶颈。测序深度测试表明，100个细菌细胞配合10M reads即可获得稳定数据，为微量样本分析奠定基础。

代谢分化的分子证据
PCA分析揭示小细胞与大细胞的转录组显著分离。差异表达分析显示：

• 大细胞高表达脂质合成基因（spt、fabD/fabF、lpxD）和细胞周期相关基因（dnaG、murC-F），富集于ATP依赖的生物合成通路
• 小细胞特异性上调维生素B₁
  获取基因tnr3、二肽酶BT_1549和RND泵操纵子（BT_2685-BT_2689），激活膜转运和碳水化合物活性酶（PUL39）

荧光原位杂交验证
HCR-FISH在单分子水平证实spt、lpxD等大细胞标志物的表达梯度，其中spt（丝氨酸棕榈酰转移酶）的缺失导致细胞缩小，与早前转座子筛选结果一致。意外的是，RND泵操纵子缺失反而增大细胞体积，而过表达则产生相反表型，暗示其通过未知的膜稳态机制调控形态。

生态与进化意义
该研究提出形态异质性可能通过两种策略增强种群适应力：

1. 代谢分工：大细胞专注合成代谢，小细胞偏向营养获取
2. 风险对冲：应对宿主饮食波动和噬菌体压力
   研究者特别指出，B. thetaiotaomicron命名的历史渊源（θ/ι/ο三种希腊字母形态）可能反映了其长期进化形成的多态性生存策略。

技术应用前景
建立的MATQ-seq流程可拓展至其他拟杆菌门物种，未来结合空间转录组和CRISPR干扰技术，有望解析CPS位点相变与形态异质性的协同机制。该方案为研究不可培养微生物的功能异质性提供了通用工具。