空间转录组解析三阴性乳腺癌三级淋巴结构中免疫检查点阻断的时空响应机制

本研究通过单RNA分子分辨率成像技术(CosMx)追踪三阴性乳腺癌(TNBC)患者接受pembrolizumab联合放疗的纵向活检样本，首次构建了三级淋巴结构(TLS)与肿瘤床互作的空间分析框架。研究发现具有高T细胞浸润的肿瘤经PD-1单抗治疗后显著消退，而基线缺乏T细胞互作的肿瘤则通过CXCL9+ 髓系细胞招募实现免疫激活，为TNBC免疫治疗分层提供了新型空间生物标志物。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，三级淋巴结构(TLS)如同"微型军事基地"，其内部B细胞、T细胞与树突细胞的精密排布直接影响抗癌战斗力。然而三阴性乳腺癌(TNBC)中这些免疫前哨站的功能差异始终成谜——为何部分患者对PD-1抑制剂响应显著而另一些需要联合放疗？这个"黑箱"问题制约着精准治疗的发展。Cedars-Sinai医疗中心的研究团队在《iScience》发表的研究，如同为肿瘤免疫战场装上了卫星定位系统，首次绘制出TLS动态演化的时空图谱。

研究人员采用单RNA分子分辨率空间转录组(CosMx)技术，分析4例TLS富集型TNBC患者接受新辅助pembrolizumab序贯联合立体定向放疗(SBRT)的纵向活检样本。通过开发计算框架整合细胞类型注释、生态位识别和梯度向量场分析，实现从基线到治疗后的多维度解析。

关键技术包括：1) 基于~1000个靶基因的CosMx空间转录组检测；2) scANVI算法实现单细胞数据标签转移；3) Delaunay三角网构建细胞互作网络；4) NicheNet模型预测配体-受体互作；5) 梯度向量场量化空间轨迹变化。样本来源于NCT03366844临床试验的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织。

Defining TLS-associated structures in spatial transcriptomic data from TNBCs
通过分层聚类鉴定出8个细胞生态位，其中生态位7(富含T/B细胞)和生态位4(恶性细胞区)分别对应TLS与肿瘤核心区。空间互作分析揭示B细胞区外围存在记忆B细胞梯度递减，而中间区出现IgG⁺
浆细胞富集，暗示B细胞分化迁移轨迹。

Cells from different TLS-associated structures show distinct phenotypes
基因集富集分析显示，TLS区的内皮细胞和炎症性癌症相关成纤维细胞(iCAF)显著上调抗原呈递通路(MHC II类分子表达增加2.1倍)，而恶性细胞区相同细胞则呈现胶原重塑特征。配体-受体分析预测恶性细胞通过VEGFA-SPP1轴塑造肿瘤血管微环境。

The response trajectory of TLS-harboring TNBCs is heterogeneous
根据基线恶性细胞区免疫浸润程度将肿瘤分为"浸润型"(pt02/pt16)和"非浸润型"(pt12/pt43)。前者具有更成熟的T/B细胞分区(空间分离度提高37%)和预存扩增的效应T细胞(clonal expansion rate达68%)，预示对pembrolizumab单药敏感。

Infiltrated TNBCs exhibit transcriptional signs of active antigen presentation at baseline
浸润型肿瘤的恶性细胞区显示更强的MHC分子表达( HLA-DRA⁺
细胞比例增加4.5倍)和CXCL13⁺
T细胞浸润。计算模型提示iCAF通过MIF信号参与维持该区抗原呈递活性。

Pembrolizumab alters immune infiltration and T cell phenotypes in TLS-enriched TNBCs
PD-1阻断后，非浸润型肿瘤的恶性细胞区出现CXCL9⁺
经典树突细胞(cDC)浸润(增加11.2倍)，伴随效应T细胞(CD8⁺
GZMB⁺
)向肿瘤核心迁移。单细胞TCR分析显示这些T细胞克隆扩增率较基线提升3.8倍。

Pembrolizumab recruits CXCL9-expressing myeloid cells in non-infiltrated TLS-rich TNBCs
空间梯度分析揭示cDC来源的CXCL9通过IFNγ反馈环路激活T细胞。该信号轴使非浸润型肿瘤获得放疗增敏性，最终在联合治疗阶段实现肿瘤清除。

这项研究开创性地揭示：1) TLS空间构型决定TNBC免疫治疗敏感性，B/T细胞分区明确性与预存效应T细胞是PD-1单药响应的关键预测指标；2) 基线"免疫冷肿瘤"可通过PD-1阻断诱导CXCL9⁺
髓系细胞招募，重塑为放疗敏感型微环境；3) 空间梯度分析方法为肿瘤免疫研究提供新范式。该成果不仅为TNBC精准免疫治疗提供生物标志物体系，其开发的CosMx分析框架更适用于多种实体瘤的免疫微环境解析。值得注意的是，研究发现PD-L1表达细胞类型存在肿瘤异质性——浸润型主要由髓系表达，而非浸润型则依赖肿瘤细胞表达，这为PD-L1检测的临床解读提供了重要启示。