冷冻电子断层扫描技术实现脑组织原位分子活检：一种通用且靶向的冷冻电镜三维重构方法

本文推荐Glynn团队开发的冷冻电子断层扫描(cryo-ET)创新工作流程，通过高压冷冻(cryo-FIB/SEM)结合等离子聚焦离子束(PFIB)铣削技术，实现了小鼠海马组织的高通量靶向结构解析。该方法突破传统细胞培养模型的局限，首次在完整脑组织中观察到突触囊泡融合、微管网络等纳米级结构特征，为神经退行性疾病研究提供了原位分子图谱新范式。

　　

Motivation
传统基于离体培养细胞的蛋白质结构研究方法难以还原真实组织环境。为解决这一技术瓶颈，研究者开发出整合高压冷冻(HPF)、冷冻荧光显微镜和等离子聚焦离子束(PFIB)铣削的联合工作流程。该技术可在哺乳动物脑组织中实现靶向区域的纳米级三维重构，为研究复杂生物系统中的分子机制提供新工具。

Highlights
• 脑组织玻璃化冷冻技术突破结构生物学研究壁垒
• 冷冻荧光图谱实现特定海马亚层精准定位
• 冷冻电子断层扫描(cryo-ET)解析突触与树突细胞骨架的亚纳米结构
• 创新性平面提取技术揭示神经元轴向排布新视角

Results
HPF载体内脑组织提取
采用振动切片机制备100-200 μm小鼠半脑切片，在3小时内完成高压冷冻。通过微米级冷冻荧光显微镜与纳米级cryo-ET的关联成像，成功靶向海马CA1区锥体层(sp)和辐射层(sr)。垂直提取方案可获得10-14个连续切片，提取成功率达91.4%。

脑组织玻璃化冷冻
评估18种冷冻保护剂组合后发现，含10%低分子量(蔗糖/乙二醇)与高分子量(葡聚糖)的混合溶液效果最佳。冷冻电镜图像显示髓鞘、突触小泡、线粒体等结构保存完好，细胞外间隙未出现化学固定导致的塌陷现象。

海马亚层靶向
利用Hoechst核染色标记CA1-sp锥体神经元，通过冷冻共聚焦显微镜定位后，采用集成荧光模块(IFM)引导PFIB铣削。在CA1-sp层观察到核染色质、核糖体聚集等特征；CA1-sr层则富含突触(56/359个断层)、微管(302/359)和轴突运输相关结构。

CA1-sr突触组织
突触前区囊泡平均直径45.4±2.2 nm，与冷冻保存数据一致。观察到7%的突触存在囊泡与质膜融合事件，包括Munc13-1样栓系蛋白介导的初始附着。突触间隙(20-30 nm)可见跨膜粘附分子，突触后区则特异性分布核糖体簇和肌动蛋白丝。

CA1-sp至CA1-sr分子组织
平面提取技术首次实现海马从腔隙分子层(slm)到起层(so)的连续采样。轴向视角显示树突微管呈57.7±22.4 nm规律间距排列，包含13/14原丝微管变体。发现微管-内质网(ER)桥接结构，以及连接相邻微管的"系链"密度。

Discussion
该技术首次在不依赖基因修饰的情况下，实现哺乳动物脑组织的原位分子成像。相比传统液态金属离子源(LMIS) FIB，氙等离子体铣削速度提升3-4倍，可在30分钟内清除500,000 μm³
组织。研究建立的C57BL/6小鼠海马分子图谱，为神经退行性疾病研究提供了基准参照系。

Limitations
冷冻保护剂孵育可能影响组织生理状态；通用荧光标记无法区分特定细胞亚型；连续切片间存在信息丢失，未来需整合体积电镜技术提升三维重建连续性。

Resource
所有数据可通过联系通讯作者Michael Grange([e-mail])获取，相关分析代码已开源。该工作获Wellcome Career Development Award等基金支持，实验动物经英国动物科学程序法案(1986)批准。