WNT3A负载微孔支架培养的唾液腺干细胞外泌体通过YWHAZ-PI3K-AKT通路促进辐射损伤的唾液腺功能恢复

针对辐射导致的唾液腺功能损伤修复难题，研究人员开发了WNT3A缓释双层微孔支架，用于培养唾液腺上皮干细胞(sgEpSCs)并高效制备外泌体(EVs)。研究发现3DWNT -EVs通过递送关键蛋白YWHAZ激活PI3K-AKT通路，显著减少细胞凋亡、促进腺泡结构再生，为头颈癌放疗患者提供无细胞治疗新策略。

　　

唾液腺功能障碍是头颈癌放疗后常见并发症，传统治疗方法效果有限。随着干细胞疗法的发展，间充质干细胞(MSCs)的旁分泌效应被认为主要通过细胞外囊泡(EVs)介导。然而EVs生产面临产量低、功能不稳定等挑战，且唾液腺中MSCs随年龄急剧减少。这些瓶颈促使研究人员探索更高效的EVs生产平台和替代细胞来源。

来自延世大学医学院的研究团队创新性地将WNT3A负载的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米纤维与聚己内酯(PCL)微孔支架结合，构建双层培养系统。该系统不仅能稳定形成唾液腺上皮干细胞(sgEpSCs)球体，还可持续释放WNT3A增强EVs产量。研究发现3D^WNT
-EVs富含14-3-3ζ/δ蛋白(YWHAZ)，通过激活PI3K-AKT信号通路显著改善辐射损伤的唾液腺功能，相关成果发表在《Bioactive Materials》。

研究采用WNT3A-PLGA/PCL复合支架培养技术、纳米粒子追踪分析(NTA)表征EVs、辐射诱导唾液腺损伤小鼠模型和类器官培养等关键技术方法。人类sgEpSCs来源于腮腺良性肿瘤患者的正常组织样本，经伦理审查批准后获取。

3.1. WNT3A释放微孔支架的表征
通过静电纺丝和光刻技术制备的双层支架，上层为直径128μm的PCL微孔，下层为WNT3A-PLGA纳米纤维(直径3.2μm)。ELISA证实支架可实现WNT3A持续释放7天，累计释放量达61.4%。

3.2. 细胞活力和WNT3A释放曲线
活死染色显示sgEpSCs在WNT-Microwell中形成更致密球体，CCK8检测证实WNT3A显著促进细胞增殖(p<0.0001)，且无细胞毒性。

3.3. sgEpSCs来源EVs的表征
NTA显示3D^WNT
-EVs产量达5.8×10⁹
颗粒/mL，是2D培养的2倍。电镜观察到典型50-150nm囊泡，Western blot验证其高表达CD9/CD81且不含calnexin污染物。

3.4. EVs促进辐射损伤唾液腺修复
小鼠模型显示3D^WNT
-EVs治疗组唾液分泌量较PBS组提高3倍(p<0.001)，腺泡结构评分接近假手术组。组织学显示该组粘蛋白(PAS)和纤维化(MTC)指标最优。

3.5. EVs通过PI3K-AKT轴发挥作用
免疫荧光证实3D^WNT
-EVs显著增强p-PI3K/p-AKT表达(p<0.001)，TUNEL阳性细胞减少80%。同时促进KRT5⁺
/KRT7⁺
上皮细胞和BHLHA15⁺
腺泡前体细胞增殖。

3.6. YWHAZ的关键作用机制
蛋白质组学发现3D^WNT
-EVs特异性富集YWHAZ。类器官实验证实LY294002(PI3K抑制剂)可逆转EVs的保护作用，Western blot显示其调控p53-BCL2-caspase3凋亡通路。

该研究突破性地将生物材料工程与EVs治疗相结合：①开发可规模化的WNT3A缓释支架，使EVs产量提升8.7倍；②首次发现sgEpSCs来源EVs通过YWHAZ-PI3K-AKT轴发挥修复作用；③为无法获取MSCs的老年患者提供自体细胞治疗新思路。值得注意的是，YWHAZ作为支架蛋白可能通过稳定PI3K复合物增强AKT信号，但其在EVs中的选择性富集机制仍需深入探索。研究为头颈癌放疗患者唾液腺保护提供了转化医学新策略，未来可进一步优化EVs制备工艺并开展临床前安全性评估。